传统的依靠培养基进行培养、分离、生化鉴定及计数的微生物研究方法，操作繁琐、检测周期长，已远远不能满足人们对微生物快速、特异、简便、敏感且低耗的快速检测及研究的要求。近年来，微生物的快速检测和自动化研究进展迅速。快速检测及其自动化已深入到分子水平，利用核酸杂交、抗原抗体反应等对微生物进行分离、检测、鉴定和计数，使微生物的检测更为灵敏、快速、准确、方便。 竞争PCR由Gilland等<[1]>于1990年首先发明，其实质是用合适的内对照模板(internal control template)与待测核酸(DNA或RNA)一起竞争参与PCR反应，并通过电泳使扩增产物在凝胶上明显分开，从而进一步进行定性或定量分析。竞争PCR能消除管间及样本间的变异，定量范围较广，能够检测2倍的差异。且此方法不需要昂贵的仪器设备，实验条件容易达到。因此本论文选用竞争PCR建立了海水养殖环境生物修复作用细菌的快速定量检测方法。 竞争PCR定量方法的关键是内标，内标设计成功与否直接影响竞争PCR反应。本文通过将细菌特定DNA片段经双酶切缺失中间一小片段，将余下的2个较大片段连接，并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物，从而获得截短的同源性片段，作为内标。制备时，将其纯化后克隆于pMD18-T载体，重组质粒经酶切和PCR鉴定，验证无误后作为竞争性模板内对照。将内标模板按一定比例稀释后分别与等体积细菌DNA进行PCR，结果表明目的DNA与竞争性DNA的扩增产物之间具有明显的线性竞争关系，结合其他细菌计数方法，建立了内标模板量与原样品中细菌数量的线性方程。本实验设计的特异性引物经PCR扩增得到了与预期PCR产物大小相当的特异性条带且敏感性较好。本竞争PCR方法的灵敏度可达到10<0.5>ng/μL，检测时间从平板计数需花3-5天到只需2天即能完成，大大提高了检测速度，节省了大量的时间和试剂，并且可以定量检测特定的细菌。 在建立了竞争PCR定量检测方法后，我们应用此方法检测了2006年冬季和2007年春季浙江象山港海湾网箱养殖区沉积环境中这两类菌的分布情况，五个区域分别为网箱养殖区、贝类养殖区、海带养殖区、离网箱较近的对照区、离网箱较远的对照区。检测结果表明，无论在春季样品中还是冬季样品中菌株Y都比菌株J<,3>多一个或两个数量级；在五个区域中网箱养殖区菌量最大，春季样品中J<,3>菌量为1.47×10<4>个/g，Y菌量为4.59×10<4>个/g；但同一区域春季与冬季相比，除离网箱较远的对照区外，同一区域J3菌春季比冬季要多出一个数量级。Y菌除了海带养殖区可看出增加外，其余几个区域并没有明显增加。