目的：α-突触核蛋白(α-Syn)是在帕金森病的发病过程中起重要作用的蛋白质。各种证据提示寡聚形式的α-Syn对多巴胺能神经元具有毒性作用，然而迄今为止尚无关于该蛋白寡聚体具有神经毒性作用的直接证据。另有证据表明，α-Syn的神经毒性作用与其破坏线粒体的功能有关，但其机制尚待阐明。在本研究中，我们在离体条件下制备α-Syn寡聚体，并根据该蛋白能够迅速通过细胞膜的特性，使其进入多巴胺能神经细胞，证明其对线粒体功能的影响。　　 材料与方法：　　 (1)α-Syn寡聚体的制备：采用原核表达的方法表达人重组α-Syn，然后顺序经过离子交换层析、疏水层析以及反相层析将其纯化。将纯化的α-Syn溶解于PBS中(浓度为100μM)，过滤除菌后，于37℃摇床振荡孵育72h，制备出α-Syn寡聚体。所制备的α-Syn寡聚体用超滤法富集。　　 (2)α-Syn单体和寡聚体向细胞内和线粒体的转运：将α-Syn加入MES23.5多巴胺能细胞培养基中，然后利用免疫荧光标记法动态观察α-Syn单体在细胞内的出现、移动和分布情况。免疫荧光标记法和Western blot被用于比较α-Syn单体和寡聚体在细胞内的形态特点和完整性。此外，分别将α-Syn单体和寡聚体与细胞孵育48h，利用免疫荧光双标法证明α-Syn与线粒体特异蛋白有无共存，利用Westen blot法检测在分离线粒体上有无α-Syn。　　 (3)α-Syn寡聚体对线粒体功能影响的测试：利用MTS法检测α-Syn寡聚体处理细胞后线粒体琥珀酸脱氢酶活性；用罗丹明标记法检测α-Syn寡聚体处理细胞后线粒体膜电位的变化。　　 结果：　　 (1)α-Syn寡聚体的鉴定：将α-Syn溶解于PBS中，浓度为100μM，37℃振荡孵育72h后，溶液呈浑浊状态，静置后分离为絮状白色沉淀和上清两部分。取上清进行Western blot分析，溶液中除了含有α-Syn单体外，还有二聚体(36kD)，三聚体(54kD)，四聚体(72 kD)和十四聚体(252 kD)。将α-Syn寡聚体混合物超滤离心，可以使单体的比例减少，但不能彻底除去单体。　　 (2)α-Syn单体和寡聚体向细胞内和线粒体的转运：将浓度为20μM的α-Syn单体加到MES23.5多巴胺细胞的培养基中，免疫荧光标记法观察到α-Syn荧光信号在孵育5min后就出现在细胞中，最初在细胞膜下，随着孵育时间的延长，荧光信号逐渐增强，并向细胞的核周移动。α-Syn寡聚体也可以进入细胞，与单体的均匀的荧光信号不同，α-Syn寡聚体在细胞内呈团块状。用α-Syn单克隆抗体与线粒体特异性蛋白prohibitin多克隆抗体进行的免疫荧光双重标记显示，α-Syn单体和寡聚体存在于线粒体上。将α-Syn单体或寡聚体处理细胞的线粒体分离后进行Western blot分析，线粒体上可以检测到α-Syn单体或寡聚体，而对照细胞的线粒体则没有α-Syn。这些实验结果说明α-Syn单体和寡聚体在进入细胞后，可以进一步转运到线粒体上。　　 (3)α-Syn寡聚体对线粒体功能的影响：将α-Syn单体或寡聚体分别处理细胞48h，可见α-Syn单体处理细胞的形态与对照细胞没有明显的不同，细胞呈伸展的梭形。然而，用α-Syn寡聚体处理的细胞却呈圆球形，细胞的突起消失。此外，α-Syn寡聚体处理细胞的琥珀酸脱氢酶的活性和线粒体膜电位明显降低。这些结果提示α-Syn寡聚体对线粒体功能具有破坏作用。　　 结论：　　 (1)α-Syn单体可以在体外适当的条件下孵育形成聚合程度不同的寡聚体。　　 (2)α-Syn单体和寡聚体均可以从细胞外转运到MES23.5多巴胺能细胞内，并进一步转运到线粒体上。　　 (3)α-Syn单体对线粒体功能没有明显的破坏作用，但α-Syn寡聚体则明显破坏线粒体的功能。　　 本研究结果为α-Syn寡聚体具有神经毒性作用提供了比较明确的证据。