背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。虽然目前乳腺癌的手术切除、化疗、放疗、内分泌治疗等手段日趋完善,但部分患者由于癌细胞的淋巴结转移或远端转移,仍难以取得令人满意的疗效。据统计,90%的乳腺癌患者死亡是由于原发肿瘤转移引起。因此,探讨乳腺癌侵袭转移的机制并探寻相应的干预措施显得尤为必要和迫切。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)主要表现为细胞失去上皮细胞的特性,如细胞表面E-cadherin表达下降;获得间质细胞的特性,如间质表型vimentin、N-cadherin等表达升高;同时细胞获得迁移能力。该过程通常情况下发生于胚胎发育期。但在细胞发生恶性变后,恶性变细胞会发生EMT改变。发生EMT的细胞上皮紧密连接解离,细胞黏连丢失,导致细胞的侵袭转移能力增加,因此EMT目前被认为是恶性肿瘤侵袭转移发生的第一步,也是最重要的一步。EMT发生涉及到众多调控机制,有些已有报道,如TGF-β诱导EMT发生中的作用;Snail、Twist、ZEB等作为转录抑制因子调节E-cadherin的表达等,但更多的原因还在研究当中。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一大类长度约为18~25bp的非编码小分子RNA,在生物体中广泛存在,并通过与靶基因mRNA的3′UTR结合实现对靶基因的转录后调控,从而参与细胞的生理和病理过程。研究表明,miRNA作为一种调控转录后基因表达的小分子RNA,有些与肿瘤EMT的发生关系密切。例如miR-21被认为可在多种肿瘤中诱导EMT的发生。研究表明miR-21可通过抑制其主要靶点PTEN的表达而促进EMT的发生。miR-200家族成员在许多恶性肿瘤包括乳腺癌中被认为是上皮表型E-cadherin的保护分子。miR-200家族成员表达降低或缺失能诱导癌细胞EMT的发生。另外在乳腺癌MCF7细胞中,Snail诱导EMT发生时,miR-200家族成员的表达受到一定程度的抑制。miR-10b定位于人2号染色体短臂3区,基因序列已经成功测序。miR-10b前体通过转运蛋白的作用由细胞核转运到细胞质,经Dicer剪切成成熟的miR-10b结构:5′-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3′,然后通过与靶基因mRNA的3′UTR结合而抑制mRNA的翻译或降解相应的mRNA,从而参与调控细胞增殖、凋亡、侵袭转移的过程。有报道指出miR-10b与多种肿瘤如:乳腺癌、肝癌、胰腺癌、垂体瘤、胶质瘤等的侵袭转移过程密切相关。但miR-10b参与肿瘤侵袭转移的机制知之甚少。鉴于此,本课题首先在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中研究miR-10b的表达,其次,体内外调控miR-10b的表达,观察其对乳腺癌MDA-MB-231细胞系EMT发生和侵袭转移、增殖的影响,最后探讨miR-10b参与乳腺癌EMT发生的可能机制。本课题包括以下四部分:第一部分:miR-10b在乳腺癌组织和细胞系中异常表达及其与临床病理学特征之间的相关性分析;第二部分:体外调控miR-10b对乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭转移能力和EMT发生的影响;第三部分:体内调控miR-10b对乳腺癌细胞系MDA-MB-231裸鼠移植瘤增殖和EMT发生的影响;第四部分:miR-10b通过TGF-β1-miR-10b-KLF11通路参与乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT发生的机制研究。第一部分:miR-10b在乳腺癌组织和细胞系中异常表达及其与临床病理学特征之间的相关性分析一、方法:1.收集53例乳腺癌组织和癌旁正常组织标本;2.取3例乳腺癌组织和癌旁正常组织标本使用Agilent mRNA芯片技术检测分析其中miRNA的表达差异,筛选出表达上调和表达下调的miRNA;3.选取其中3种表达上调的miRNA和3种表达下调的miRNA,运用荧光定量RT-PCR检测其在53例乳腺癌组织和癌旁正常组织标本中的表达水平,以验证芯片检测结果;4.分析在乳腺癌组织表达上调的miR-10b与乳腺癌组织临床病理学特征之间的相关性;5.荧光定量RT-PCR检测miR-10b在3种乳腺癌细胞系MCF-7,MDA-MB-231、MDA-MB-435和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达水平,分析其与乳腺癌发生及侵袭转移的关系;6.所有数据均使用SPSS19.0软件进行统计分析。单因素方差分析法分析多指标间差异,两个指标间的进一步分析则采用LSD-t检验方法;两组间的均数间比较采用t检验(t-test);差异性分析采用卡方检验;相关性分析采用Sperman相关分析。以α=0.05为显著性检验标准。二、结果1.使用Agilent mRNA芯片技术检测筛选得到59个差异表达的miRNA基因,其中19个miRNA表达上调,40个miRNA表达下调。miR-10b在乳腺癌组织中表达明显升高。2.荧光定量RT-PCR检测3种在乳腺癌组织中表达上调的miR-127-3p(0.846±0.103);miR-580-3p(1.076±0.212);miR-10b(1.114±0.096)和3种在乳腺癌组织中表达下调的miR-1207-5p(0.389±0.638);miR-27a(0.328±0.067);miR-495(0.534±0.075),检测结果与芯片检测结果完全一致,证明芯片结果正确、可靠。3.miR-10b在乳腺癌组织中的表达与临床病理学特征之间的相关性分析结果显示miR-10b在有腋窝淋巴结转移组中的表达明显高于无腋窝淋巴结转移组(p=0.023);同样有远处转移的瘤组织miR-10b的表达显著高于无远处转移的瘤组织(p<0.01)。4.荧光定量RT-PCR结果显示miR-10b在乳腺癌细胞系MDA-MB-231(1.433±0.118)、MDA-MB-435(1.282±0.099)、MCF-7(1.004±0.088)中的表达均明显高于其在正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(0.406±0.080)中的表达;且miR-10b在侵袭转移能力高的MDA-MB-231、MDA-MB-435中的表达又显著高于其在侵袭转移能力低的MCF-7细胞系中的表达。第二部分:体外调控miR-10b对乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭转移能力和EMT发生的影响一、方法1.合成miR-10b inhibitor,Lipofectamine 2000转染入高侵袭性人乳腺癌MDA-MB-231细胞,以转染miRNA negative control及未转染细胞作为阴性对照和空白对照。2.荧光定量RT-PCR检测转染后48h,各组MDA-MB-231细胞miR-10b的表达。3.Boyden Chamber侵袭小室实验检测转染后48h各组MDA-MB-231细胞穿膜能力。4.划痕实验检测转染后48h各组MDA-MB-231细胞划痕愈合能力。5.CCK8实验检测转染后24、48h和72h各组MDA-MB-231细胞增殖能力。6.荧光定量RT-PCR检测转染后48h,各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA的表达。7.Western blot检测转染后48h,各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin蛋白的表达。8.结果数据采用SPSS19.0软件统计分析,计量资料采用X±S表示;两组间均数的比较用t-test;两组以上均数的比较用ANVOA分析。显著性水准为α=0.05。二、结果1.荧光定量RT-PCR检测结果显示,转染miR-10b inhibitor后48h,转染组细胞miR-10b的相对表达量为0.380±0.055,与对照组相比表达水平明显下降,差异有统计学意义(p<0.01)。2.Boyden Chamber侵袭小室实验检测结果显示,转染miR-10b inhibitor组细胞穿膜细胞数为48.73±12.28,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)。3.划痕实验检测显示,转染miR-10b inhibitor组细胞划痕修复能力最弱,为0.306±0.048,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)。4.CCK8实验检测显示,与对照组相比,转染miR-10b inhibitor组细胞增殖效率在48h后出现明显的抑制(p<0.05)。5.荧光定量RT-PCR检测结果显示,转染miR-10b inhibitor后48h,E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA的表达变化明显。其中,E-cadherin mRNA(0.78±0.03)的表达较对照组明显升高,而vimentin mRNA(0.46±0.06)和N-cadherin mRNA(0.52±0.06)表达较对照组下降显著,差异有统计学意义(p<0.05)。6.Western blot检测结果同样显示,转染miR-10b inhibitor后48h,转染组E-cadherin蛋白的表达较对照组明显升高,而vimentin蛋白和N-cadherin蛋白表达较对照组下降显著,差异有统计学意义(p<0.05)。第三部分:体内调控miR-10b对乳腺癌细胞系MDA-MB-231裸鼠移植瘤增殖和EMT发生的影响一、方法1.将浓度为1×107/ml对数生长期MDA-MB-231细胞接种于裸鼠前肢右腋背部皮下,构建MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型。2.将成功构建的乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型随机分为3组,分别给予miR-10b antagomir、miRNA negative control和PBS处理,隔日瘤旁注射1次,共注射14次。3.游标卡尺测量各组裸鼠移植瘤生长,绘制肿瘤生长曲线。实验结束断颈处死裸鼠,剥离瘤体,称取瘤重。4.各组裸鼠移植瘤剥离瘤体组织一部分液氮保存,荧光定量RT-PCR检测miR-10b的表达。5.荧光定量RT-PCR检测各组瘤组织中E-cadherin、vimentin、N-cadherin mRNA的表达。6.各组裸鼠移植瘤剥离瘤体组织一部分常规石蜡包埋,病理切片,HE染色;免疫组织化学染色检测各组瘤组织中E-cadherin、vimentin、N-cadherin蛋白的表达。7.SPSS19.0软件分析处理数据,计量资料采用均数±标准差(X±S)表示,两个均数间的比较采用t-test,单因素方差分析应用于多个样本均数间的比较,检验标准为а=0.05。二、结果1.皮下注射裸鼠1w后,接种部位可见小结节,说明MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型构建成功。2.各组裸鼠处理前移植瘤体积差别无统计学意义,经过不同方法处理后,结果显示,miR-10b antagomir处理组裸鼠移植瘤体积(886±76.51 mm3)明显小于两对照组体积,差异有统计学意义(p<0.05)。所绘制移植瘤生长曲线也显示miR-10b antagomir处理组裸鼠移植瘤生长慢于两对照组。3.处死裸鼠剥离瘤体后称重,结果显示,miR-10b antagomir处理组裸鼠移植瘤剥离瘤体重量(0.460±0.030g)明显小于两对照组重量,差异有统计学意义(p<0.05)。4.荧光定量RT-PCR的结果显示,与对照组相比,miR-10b antagomir处理组miR-10b的表达明显下降(0.438±0.045),差异有统计学意义(p<0.01)。5.HE染色结果显示miR-10b antagomir处理组瘤细胞较小,染色质较疏松,瘤组织间有点、片状坏死,而对照组瘤细胞大小不一,异形性明显。6.荧光定量RT-PCR的结果显示,与对照组相比,miR-10b antagomir处理组E-cadherin mRNA的表达有所升高(0.62±0.04),而vimentin(0.57±0.07)和N-cadherin mRNA(0.61±0.03)的表达均下降,差异有统计学意义(p<0.05)。7.免疫组织化学结果显示,与对照组相比,miR-10b antagomir处理组E-cadherin蛋白的表达有所升高,而vimentin和N-cadherin蛋白的表达均下降,差异有统计学意义(p<0.05)。第四部分:miR-10b通过TGF-β1-miR-10b-KLF11通路参与乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT发生的机制研究。一、miR-10b在TGF-β1诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT发生中的作用1.10ng/m L TGF-β1作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞48h,以MDA-MB-231细胞作为空白对照。2.荧光定量RT-PCR和western blot检测作用后48h,各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA和蛋白的表达。3.Boyden Chamber侵袭小室实验检测作用后48h各组MDA-MB-231细胞穿膜能力。4.划痕实验检测作用后48h各组MDA-MB-231细胞划痕愈合能力。5.CCK8实验检测作用后24、48h和72h各组MDA-MB-231细胞增殖能力。6.荧光定量RT-PCR检测作用后48h各组MDA-MB-231细胞miR-10b的表达。7.10ng/m L TGF-β1作用同时转染miR-10b inhibitor于乳腺癌MDA-MB-231细胞48h;以10ng/m L TGF-β1作用同时转染miRNA negative control;单独10ng/m L TGF-β1作用和空白细胞作为对照。8.荧光定量RT-PCR和western blot检测作用后48h,各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA和蛋白的表达。9.Boyden Chamber侵袭小室实验检测作用后48h各组MDA-MB-231细胞穿膜能力;划痕实验检测作用后48h各组MDA-MB-231细胞划痕愈合能力;CCK8实验检测作用后24、48h和72h各组MDA-MB-231细胞增殖能力。10.SPSS19.0软件分析处理数据,计量资料采用均数±标准差(X±S)表示,两个均数间的比较采用t-test,单因素方差分析应用于多个样本均数间的比较,检验标准为а=0.05.(二)结果1.荧光定量RT-PCR和western blot结果显示TGF-β1作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,E-cadherin mRNA(0.21±0.04)和蛋白的表达均明显下降,差异有统计学意义(p<0.01);而vimentin和N-cadherin mRNA(1.22±0.05,1.12±0.07)和蛋白的表达均有上升,差异有统计学意义(p<0.05)。2.Boyden Chamber侵袭小室实验检测结果显示,TGF-β1作用组细胞穿膜细胞数为165.30±15.28,较对照组升高,差异有统计学意义(p<0.01)。3.划痕实验检测显示,TGF-β1作用组细胞划痕修复能力增强,为0.736±0.028,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)。4.CCK8实验检测显示,与对照组相比,TGF-β1作用组细胞增殖效率明显增加(p<0.05)。5.荧光定量RT-PCR检测结果显示,TGF-β1作用组细胞,miR-10b的表达(1.815±0.650)较对照组升高显著,差异有统计学意义(p<0.01)。6.进一步实验证实,miR-10b inhibitor表达下降可以抑制TGF-β1作用所诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT的发生。TGF-β1和miR-10b inhibitor共同作用组E-cadherin mRNA(0.37±0.08)和蛋白的表达与TGF-β1和miRNA negative control共同作用组和TGF-β1单独作用组相比,有所上升,差异有统计学意义(p<0.05);而vimentin和N-cadherin mRNA(1.05±0.04,0.96±0.07)和蛋白的表达则有下降,差异有统计学意义(p<0.05)。7.抑制miR-10b的表达可抑制因TGF-β1作用所增强的乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭、转移和增殖能力。TGF-β1和miR-10b inhibitor共同作用组侵袭、转移和增殖能力较TGF-β1和miRNA negative control共同作用组和TGF-β1单独作用组侵袭、转移和增殖能力有所下降,差异有统计学意义(p<0.05)。二、miR-10b通过调控KLF11的表达参与乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT发生(一)方法1.化学合成KLF11 si RNA转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,以转染negative si RNA和未转染细胞作为阴性对照和空白对照。2.荧光定量RT-PCR和western blot检测转染后48h各组MDA-MB-231细胞KLF11 mRNA和蛋白的表达。3.Boyden Chamber侵袭小室实验检测转染后48h各组MDA-MB-231细胞穿膜能力。4.划痕实验检测转染后48h各组MDA-MB-231细胞划痕愈合能力。5.CCK8实验检测转染后24、48h和72h各组MDA-MB-231细胞增殖能力。6.荧光定量RT-PCR检测转染后48h,各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA的表达。7.Western blot检测转染后48h,各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin蛋白的表达。8.电脑软件miRDB和Target Scan预测miR-10b的潜在靶基因。9.构建含野生型KLF11 3′UTR的重组载体pmir GLO-KLF11-WT和突变型重组载体pmir GLO-KLF11-MUT与miR-10b inhibitor或negative si RNA共同转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,双荧光素酶报告实验验证靶基因。10.使用荧光定量RT-PCR和western blot方法检测改变miR-10b表达对KLF11表达的影响,进一步证明二者之间的靶向结合关系。11.共转染KLF11si RNA和miR-10b inhibitor,同时以共转染miR-10b inhibitor和negative si RNA,单独转染miR-10b inhibitor和空白细胞作为对照。12.荧光定量RT-PCR和western blot检测转染后48h,各组MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA和蛋白的表达。13.Boyden Chamber侵袭小室实验检测作用后48h各组MDA-MB-231细胞穿膜能力;划痕实验检测作用后48h各组MDA-MB-231细胞划痕愈合能力;CCK8实验检测作用后24、48h和72h各组MDA-MB-231细胞增殖能力。14.SPSS19.0软件分析处理数据,计量资料采用均数±标准差(X±S)表示,两个均数间的比较采用t-test,单因素方差分析应用于多个样本均数间的比较,检验标准为а=0.05。(二)结果1.荧光定量RT-PCR和western blot结果显示乳腺癌MDA-MB-231细胞转染KLF11 si RNA 48h后,与对照组相比,KLF11 mRNA(0.145±0.10)和蛋白的表达均明显下降(p<0.01),说明所设计靶向KLF11 si RNA有效。2.Boyden Chamber侵袭小室实验检测结果显示,转染KLF11 si RNA组细胞穿膜细胞数为135.26±36.41,较对照组升高,差异有统计学意义(p<0.05)。3.划痕实验检测显示,转染KLF11 si RNA细胞划痕修复能力增强,为0.697±0.049,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)。4.CCK8实验检测显示,与对照组相比,转染KLF11 si RNA组细胞增殖能力明显增加(p<0.05)。5.荧光定量RT-PCR检测结果显示,转染KLF11 si RNA后48h,E-cadherin、vimentin和N-cadherin mRNA的表达变化明显。其中,E-cadherin mRNA(0.22±0.06)的表达较对照组明显下降,而vimentin mRNA(1.29±0.07)和N-cadherin mRNA(1.07±0.05)表达较对照组升高显著,差异有统计学意义(p<0.05)。6.Western blot检测结果同样显示,转染KLF11 si RNA后48h,转染组E-cadherin蛋白的表达较对照组明显下降,而vimentin蛋白和N-cadherin蛋白表达较对照组升高显著,差异有统计学意义(p<0.05)。7.电脑软件miRDB和Target Scan预测miR-10b的潜在靶基因,KLF11为其潜在靶基因之一。8.分别构建含野生型KLF11 3′-UTR区的载体pmir GLO-KLF11-WT和含突变型KLF11 3′-UTR区的载体pmir GLO-KLF11-MUT。共转染miR-10b inhibitor和pmir GLO-LF11-WT组乳腺癌MDA-MB-231细胞荧光素酶活性显著升高,与共转染miR-10b inhibitor和pmir GLO-KLF11-MUT组,共转染miRNA negative control和pmir GLO-KLF11-WT,共转染miRNA negative control和pmir GLO-KLF11-MUT相比,差异有统计学意义(p<0.05)。提示miR-10b可与KLF11的3′-UTR区结合。9.为了进一步验证二者的结合关系,在转染miR-10b inhibitor的乳腺癌MDA-MB-231细胞中检测KLF11 mRNA和蛋白的表达,结果显示,与转染miRNA negative control(0.428±0.03)和空白MDA-MB-231细胞(0.427±0.02)相比,转染组细胞KLF11 mRNA(0.660±0.06)和蛋白的表达明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。提示miR-10b可与KLF11的3′-UTR区结合而抑制其表达,进一步验证二者之间的靶向结合关系。10.进一步实验证实,KLF11表达下降可以挽救miR-10b inhibitor所抑制的乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT的发生。共转染KLF11si RNA和miR-10b inhibitor组E-cadherin mRNA(0.58±0.06)和蛋白较共转染negative si RNA和miR-10b inhibitor组及单独转染miR-10b inhibitor组E-cadherin mRNA和蛋白表达下降,差异有统计学意义(p<0.05)。共转染KLF11si RNA和miR-10b inhibitor组vimentin和N-cadherin mRNA(0.76±0.06;0.75±0.05)和蛋白表达较共转染negative si RNA和miR-10b inhibitor及单独转染miR-10b inhibitor组vimentin和N-cadherin mRNA和蛋白表达上升,差异有统计学意义(p<0.05)。11.抑制KLF11的表达可挽救因miR-10b表达下降所抑制的乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭、转移和增殖能力。共转染KLF11si RNA和miR-10b inhibitor组侵袭能力较共转染negative si RNA和miR-10b inhibitor组及单独转染miR-10b inhibitor组侵袭、转移和增殖能力升高,差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.在乳腺癌组织共筛选出59个差异表达的miRNA基因,其中19个miRNA表达上调,40个miRNA表达下调。miR-10b在乳腺癌组织中表达明显升高,且miR-10b的高表达与乳腺癌组织的腋窝淋巴结转移和远处转移密切相关。2.miR-10b在乳腺癌细胞系中的表达与乳腺癌细胞的侵袭能力密切相关。3.miR-10b在乳腺癌细胞系EMT发生密切相关。4.miR-10b通过TGF--β1-miR-10b-KLF11信号通路参与乳腺癌细胞系EMT发生和侵袭转移过程。5.miR-10b可作为有效靶点在乳腺癌的诊断和治疗中发挥重要作用。