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目前,单抗药物以靶向性强、疗效明确、副作用小等优势,正在向自身免疫性疾病、感染性疾病、心血管疾病、糖尿病等新的治疗领域迅速扩展,已经成为生物制药中增长最快的领域。单抗药物表达系统的金标准是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)表达系统,但通过重组DNA技术构建的CHO细胞表达系统在生产单抗药物时,会产生宿主的内源性蛋白(host cell protein,HCP),这些内源蛋白的残留至成品中随单抗药物进入人体后,存在潜在的免疫原性,另外HCP的存在还会影响抗体药物的稳定性。为了保证药物的质量,必须控制HCP在抗体药物中的残留,因此需要稳定且灵敏度高的检测方法来检测抗体药物中的HCP。本研究通过发酵空载体转染的CHO制备HCP抗原,经皮下多次免疫新西兰大白兔,最终获得的抗体血清滴度可以达到640,000,经颈动脉取血采集血清,protein A柱层析纯化抗体,获得浓度为15.2 mg/ml、纯度为96.9%的HCP抗体。通过双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)鉴定,自制 CHO HCP 抗体对CHO HCP的覆盖率为54.6%,商业化抗体(CYGNUS公司)对CHO HCP抗体的覆盖率仅为28.8%,说明自制抗HCP抗体比商业化抗体更适合本实验室CHO细胞平台的HCP残留检测。本研究通过BCA法对HCP标准品进行标定,标定结果为1.159mg/ml,并将HCP标准品用1%的BSA溶液稀释20000倍建立HCP随行对照品,用双抗体夹心ELISA方法进行定量,采用20份供试品的浓度均值±3SD值作为随行对照品的浓度范围,确定该随行对照品的浓度范围为50.573～65.755 ng/ml,以此作为CHO HCP标准品放置过程是否稳定的依据。通过棋盘滴定法确定最佳包被抗体工作浓度和最佳二抗工作浓度分别为1:5000倍稀释和1:500倍稀释,建立CHO HCP检测的双抗体夹心ELISA方法,本方法空白干扰较小,单抗药物和非CHO细胞宿主蛋白对检测无干扰,专属性良好;低、中、高各6份重复性溶液的RSD值(n=6)分别为2.65%、0.70%、1.59%;中间精密度溶液6份供试品的RSD值(n=6)分别为3.02%、0.97%、1.15%;重复性与中间精密度共12份供试品的RSD值(n=12)分别为3.25%、0.81%、1.89%。本方法的线性范围为6.25～200ng/ml,四参数拟合方程为Y=3.45-(?),拟合度 R2=0.999;定量限为 6.25ng/ml;25ng/ml、50ng/ml、75 ng/ml三个浓度下加标的回收率范围分别 110.4%～112.1%,100.8%～101.6%,98.0%～103.0%,回收率的RSD值分别为0.74%、0.39%、2.45%;二抗孵育时间在1～2h内对本方法无影响;显色时间在3～10min范围内对本方法无影响。本研究通过用市售试剂盒检测CHO HCP标准品,检测结果与标定结果相当;同时用自建双抗夹心ELISA方法和市售试剂盒检测4批单抗药物原液,检测结果显示商业化试剂盒检测结果比自建方法低,说明自建方法对HCP残留控制更严格,自建方法更适合于本平台的CHO HCP检测。