【摘 要】
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用DNA重组技术将已克隆的猪IL—6 cDNA片断插入pGEX—1λT质粒,构建了猪IL-6基因的原核表达质粒pGPIL-6,转化大肠杆菌,以BamH I酶切筛选、Pst I酶切鉴定转化子,获得了含740bp插入
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用DNA重组技术将已克隆的猪IL—6 cDNA片断插入pGEX—1λT质粒,构建了猪IL-6基因的原核表达质粒pGPIL-6,转化大肠杆菌,以BamH I酶切筛选、Pst I酶切鉴定转化子,获得了含740bp插入克隆基因正确的重组子。以IPTG诱导融合蛋白表达,经RT-PCR检测发现740bp的特异性IL-6条带;通过SDS-PAGE分析,在49KD处出现GST—PIL6融合蛋白条带,其表达量占总细菌蛋白量的30%,证明猪IL-6基因得到了正确转录和表达。从制备性聚丙烯酰胺凝胶中回收融合蛋白,用MTT法测定重组蛋白刺激小鼠脾淋巴母细胞增殖反应活性,并以重组蛋白免疫家兔制备抗猪IL-6滴度为128,000的高免兔血清。 用生物素标记正向引物,和反向引物一起扩增质粒pGEX-1λT上一段700bpDNA片断作为生物素化的DNA片断;以兔抗猪IL-6高免血清为一抗,生物素化的羊抗兔IgG为二抗,用低本底亲和素将生物素标记的700bp片断与二抗连接起来,再通过PCR扩增DNA片断,建立了猪IL-6的免疫PCR检测方法。通过与ELISA法比较,发现新建立的免疫PCR法灵敏度为1fg/ml猪IL-6,是ELISA法的10~5倍,是目前已报道的检测猪IL-6最灵敏的方法。 应用建立的免疫PCR法检测猪细胞因子基因转基因表达疫苗免疫猪的血中IL—6变化情况做了研究,结果发现:猪IL-6基因转基因表达免疫猪血液中IL—6的含量明显升高,其机体免疫应答增强,提示细胞因子基因可作为良好的免疫增强剂。
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