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中文摘要背景(background):钩端螺旋体(简称钩体)分为致病性钩体和非致病性钩体两大类。非致病性钩端螺旋体存在于潮湿土壤和地表水中,属于腐生性愿核细胞型微生物,不引起人或动物疾病。致病性钩体中目前至少确定有7种基因种,如Leptospira interrogans、Leptospira borgpetersenii、Leptospira kirschneri和Leptospira weilii等,其中问号钩体(L. interrogans)是流行最广的致病性钩体。由致病性钩体感染引起的钩体病是全球流行的人畜共患传染病,好发于热带或亚热带国家或地区,我国也是钩体病主要疫区之一。致病性钩体有强大的侵袭力,能迅速通过皮肤或黏膜侵入血流,引起中毒性败血症症状,如高热、头痛、肌痛等,钩体随血流侵入肺、肝、肾等脏器,引起肺出血、黄疸和肾功能损伤,常因呼吸或肾功能衰竭而导致死亡,其中肺弥漫性出血钩体病死亡率高达50%以上。鼠类和家畜是钩体主要动物宿主,感染钩体后虽无明显症状,但可长期甚至终身从尿液排出钩体,污染土壤或水系成为疫源地。然而,钩体不产生任何典型的外毒素,其脂多糖(LPS)毒性仅为大肠杆菌LPS的1/10～1/100,故钩体毒力因子及其致病机制至今所知甚少。细菌胶原酶可以有效降解宿主结缔组织及胞外基质(extracellular matrix)中的胶原蛋白,是不少病原菌重要的侵袭性毒力因子之一。在问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组中,含有一个胶原酶编码基因(colA).如前所述,致病性钩体有强大的侵袭力,但至今未见致病性钩体胶原酶功能及其致病性的研究报道。目的(aim)：了解钩体胶原酶水解不同胶原蛋白底物能力及特异性、最佳工作pH和金属离子浓度等酶动力学特征,采用问号钩体黄疸出血群赖型赖株胶原酶基因敲除突变株(colA)金地鼠感染模型,采用基因敲除技术了解钩体胶原酶基因对金地鼠毒力、肺和肝及肾组织中钩体载量及组织病变的影响,阐明钩体胶原酶工作机制及其致病意义。方法(methods):以我国流行最广的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用高保真PCR扩增全长colA基因,T-A克隆后测序。以pET42a为表达载体、E.coli BL21DE3为表达宿主菌,构建胶原酶原核表达系统E.coli BL21DE3pET42a-colA采用0.5mM IPTG28℃诱导E.coli BL21DE3pET42a-colA表达重组ColA蛋白(rColA)、Ni-NTA亲和层析柱提纯rColA,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检查rColA表达情况及提纯效果。采用多种胶原酶蛋白底物(多种胶原蛋白、Azocoll和Pz-肽)、不同pH和金属离子及浓度缓冲液,了解钩体重组胶原酶最佳胶原蛋白底物、pH和金属离子及其浓度等酶动力学特征。采用实时荧光定量RT-PCR及Western Blot检测感染问号钩体黄疸出血群赖型赖株感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或人肾上皮细胞(HEK293)后colA基因表达水平变化及分泌情况。采用基于自杀质粒的基因敲除技术,构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株胶原酶基因敲除突变株(colA-)。将不同浓度colA-突变株或野生株腹腔注射攻击钩体敏感动物金地鼠,了解colA-突变株或野生株对金地鼠毒力差异(LD50)。采集colA-突变株与野生株感染金地鼠的肺、肝、肾组织标本,固定、包埋、切片后分别HE和银染色,观察各组织标本中钩体载量及组织病变的差异。结果(results):我们克隆的钩体colA基因序列与GenBank中公布的问号钩体黄疸出血群赖型赖株钩体colA基因序列有很高的相似性。所构建的钩体colA基因原核表达系统E.coli BL21DE3pET42a-colA能有效表达目的重组蛋白rColA, Ni-NTA亲和层析柱纯化的rColA经SDS-PAGE后在凝胶中显示为单一的蛋白条带。rColA在37℃、pH7.4、0.4mM CaCl2-50mM Tris-HCl缓冲液中有最佳水解底物的效果,尽管rColA能在不同程度上水解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白及Azocoll、Pz-肽广泛的底物特异性,但最佳水解底物为Ⅲ型胶原蛋白。Western Blot检测结果显示,问号钩体黄疸出血群赖型赖株EMJH培养物上清中未检出ColA蛋白,但感染人脐静脉细胞(HUVEC)和人肾上皮细胞(HEK293)后colA-mRNA水平迅速升高并在感染细胞后6h达到峰值,问号钩体黄疸出血群赖型赖株与HUVEC或HEK293细胞共培养物上清中可检出ColA蛋白。问号钩体赖株colA-突变株及野生株对金地鼠的LD50分别约为108和106。colA-突变株感染的金地鼠肺、肝、肾组织中钩体载量明显低于野生株,肺、肝、肾组织病变也明显轻于野生株。结论(conclusion):问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因表达产物ColA是一种胶原酶,对不同胶原酶底物具有广泛但不同程度的水解活性,但其最佳水解底物为Ⅲ型胶原蛋白。问号钩体赖株在体外培养基中不分泌ColA蛋白,但感染宿主细胞后ColA蛋白表达水平显著升高并可外分泌。colA基因敲除的问号钩体赖株对金地鼠毒力明显减弱,肺、肝和肾组织中钩体载量显著减少,组织病变程度也显著下降。综上所述,胶原酶ColA是在问号钩体致病过程中发挥重要作用的毒力因子。