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研究背景及目的骨性关节炎(osteoarthritis,OA)又称退化性骨关节病,是一种常见的关节软骨退行性疾病,多发于60岁以上的老年人,以关节软骨的退行性变化、破坏及继发性骨质增生为特征,以关节疼痛和功能障碍为主要临床表现。目前我国60岁以上的人群中发病率约在50%-80%,是老年人中常见的致残疾病之一,严重影响患者的生活质量,对家庭和社会造成严重的经济负担。随着我国逐步步入老年化社会,骨性关节炎发病率将逐渐升高。然而,骨性关节病缺乏有效的治愈手段。目前临床上主要是以减轻疼痛,阻止和延缓病程,保持或改善关节活动度,减缓关节功能的受损,提高患者的生活质量为治疗手段。尽管目前对骨关节炎的发病机制还不完全清楚,大量的实验数据表明成骨细胞的异常调控在骨性关节炎中发挥着重要的作用,比如在骨性关节炎中,异常表达OPG和RANKL导致了骨的异常修饰以及骨的矿化程度的减少。异常的基因表达影响成骨细胞的形成与分化以及成骨的修饰最终导致骨性关节炎的发生。另外,成骨细胞所产生的大量的生长因子,信号分子,转录因子也参与到骨性关节炎的发病过程中。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是广泛存在的一类转录本长度大200个核苷酸的非编码RNA。起初它被普遍认为是一种转录噪音,是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物,不具有生物学功能。然而,随着生物技术的不断发展,有文献研究表明lncRNA具有转录调控功能,比如近端和远端基因表达调控,转录因子活性,染色质修饰,基因组印记等。另外,lncRNA同样可以影响mRNA转录过程,转录后修饰,蛋白质的转运。异常的lncRNA常被认为与人类的各种疾病有关,比如,LncRNA GAS5在骨性关节炎中高度表达并且促进的骨性关节炎疾病的进展,MALAT1与肝癌,肺癌以及结肠癌的预后和代谢有关,XIST在各种肿瘤中表达异常等。我们的研究主要对lncRNA Dio3os,它主要位于Dlk1-Dio3印记基因组簇,该簇定位于人的14号染色体上和鼠的12号染色体上,跨越基因组约1MB,该区域包含三个来自父源印记蛋白编码基因(Dlk1,Rt11,and Dio3)以及多个来源于母源等位基因长链非编码RNA和小的非编码RNA(比如Meg3,Rian,Dio3os and MiR1247 等)。长链非编码 RNA Dio3os(Long non coding RNA Dio3os,LncRNA Dio3os)位于该印记基因簇的远端,转录方向与蛋白编码基因Dio3相反的的双向LncRNA,在人和鼠源中,除第一个外显子1高度同源外,LncRNA Dio3os在其他外显子的同源性较差并且没有开放阅读区。有研究表明,LncRNA Dio3os在许多组织中都有表达,其RNA在不同组织的含量能够反映Dio3基因的表达水平。比如既往研究表明,LncRNA Dio3os在大鼠的棕色脂肪前体细胞以及大脑,小鼠的子宫中mRNA的表达水平与编码基因Dio3 mRNA的表达水平存在相关性。虽然,有文献报道在小鼠子宫基质细胞中,LncRNA Dio3os调控编码基因Dio3。然而具体的功能和机制仍不清楚。而在成骨细胞株中,LncRNADio3os是否也调控编码基因Dio3,目前仍不清楚。为此,我们拟探讨LncRNA Dio3os在来源于小鼠颅骨的前体成骨细胞株MC3T3-E1细胞株中对成骨的形成和分化影响及其可能的机制,进而为OA预后的判断,及新的治疗途径提供思路。研究对象与方法1.检测LncRNA Dio3os随成骨细胞分化的表达分布及其与临近编码基因Dio3的关系MC3T3-E1细胞培养于aMEM完全培养基中(含10%血清,2 mM甘氨酸,1%双抗),置于5%CO2,37度孵箱中。利用成骨细胞分化液诱导其向成骨细胞分,每隔2天更换新鲜的成骨分化液并在特定的时间点收集细胞用于后续实验。使用TRIZOL法提取RNA并合成cDNA.RT-qPCR检测LncRNA Dio3os以及临近编码基因Dio3在来源于小鼠颅骨的前体成骨细胞株MC3T3-E1细胞株中不同分化时间段的表达分布情况,评价其与成骨形成和分化以及与临近编码基因Dio3的关系。2.利用成骨抑制性药物1,25-二羟基维生素D3干扰MC3T3-E1细胞使用不同浓度的1,25-二羟基维生素D3干扰MC3T3-E1细胞48小时后,通过RT-qPCR检测LncRNA Dio3os以及临近编码基因Dio3表达变化,评价其二者表达相关性以及对成骨刺激因子的反应情况。3.构建LncRNA Dio3os稳定过表达细胞株评价其对临近编码基因Dio3以及成骨形成和分化的影响在NCBI数据库中查找LncRNA Dio3os序列(序列号:353504),根据酶切位点Nhe I设计引物,根据TAKALA公司CloneAmp HiFIpremix试剂盒说明书PCR扩增目的基因并将其克隆至PCDH质粒中,通过测序验证质粒构建成功。病毒包装前一天进行HEK293T细胞种板。具体如下:细胞以1.5*10^密度种板至100mm培养皿中,含较低抗生素的完全DMEM培养液。使用转染试剂PEI将实验组过表达载体(对照组为PCDH空载体)转染至HEK293T细胞中。收集24,48,72小时病毒上清液,超速离心浓缩病毒,重悬于50Mm TE溶液。必要时进行病毒滴度检测。转染前一天进行MC3T3-E1细胞种板,孵箱培养过夜。次日,转染前更换含新鲜培养液。通过慢病毒转染目的细胞MC3T3-E1细胞株,1000离心90分钟。通过流式筛选GFP表达细胞。通过RT-qPCR验证稳定过表达LncRNA Dio3os构建成功。为了评估LncRNA Dio3os在成骨细胞中生理功能,我们应用RT-qPCR和ALP在稳定过表达细胞株中临近编码基因Dio3以及成骨变化。4.构建LncRNA Dio3os稳定敲除细胞株评价其对临近编码基因Dio3以及成骨形成和分化的影响设计SgRNAs在lncRNA Dio3os分别位于5’端和3’端,将其克隆至lentiCRISPR v2质粒中,并通过测序验证。利用HEK293t包装病毒,并收集病毒上清液感染目的细胞MC3T3-E1 48小时后,利用嘌呤霉素进行筛查1周,挑取单克隆细胞株并通过PCR以及测序验证。通过RT-qPCR验证稳定敲除LncRNA Dio3os构建成功。为了评估LncRNA Dio3os在成骨细胞中生理功能,我们应用RT-qPCR和ALP在稳定敲除细胞株中临近编码基因Dio3以及成骨变化。5.统计学分析实验数据在SPPP13.0软件进行统计学分析,采用方差分析对多组别组间差异进行分析,采用双尾t检验对两组间进行分析比较,设定显著性水平a=0.05,当P值小于0.05,认为该差异具有统计学意义。结果1.LncRNA Dio3os在成骨细胞株MC3T3-E1表达水平在未分化的MC3T3-E1细胞株中,LncRNA Dio3os表达水平较高,然而随着成骨细胞的分化,其表达急剧降低。更重要的是,LncRNA Dio3os和临近编码基因Dio3表达水平呈正性相关性。目前,对1,25-二羟基维生素D3在成骨的形成和分化是明确的。为了评估LncRNA Dio3os对成骨形成的作用,我们使用不同浓度的1,25-二羟基维生素D3干扰MC3T3-E1细胞48小时后,提取细胞RNA并通过RT-qPCR检测成骨标志基因,LncRNA Dio3os以及临近编码基因Dio3.结果显示:1,25-二羟基维生素D3干扰MC3T3-E1细胞48小时后,显著的抑制了成骨标志基因RUNX2和OCN的表达。然而,1Ong/ml低剂量的1,25-二羟基维生素D3明显的促进了长链非编码RNA Dio3os和临近编码基因Dio3mRNA的表达,随着剂量的增多,二者的表达有所减少,然而仍然维持较高的表达水平。2.构建MC3T3-E1稳定过表达目的基因LncRNA Dio3os细胞株PCR扩增出来的目的基因经双酶切琼脂糖凝胶电泳图证实与实际大小相符合(lncRNA Dio3os大小约为1380bp,电泳胶图实际大小符合预期大小,切胶回收并送公司直接测序后结果与NCBI数据库基因序列比对一致。通过以PEI阳离子基因转染试剂将对照组(空载体)及实验组(LncRNA Dio3os质粒)转染至HEK293T细胞进行病毒包装,收集病毒上清液并浓缩感染目的细胞MC3T3-E1。转染24-48小时后,在绿色荧光倒置显微镜下可见MC3T3-E1细胞表达GFP。同时,通过RT-qPCR检测实验组和对照组中LncRNA Dio3os表达差异。结果显示:同对照组相比,实验组中的LncRNA Dio3os表达增多近6倍。表明成功构建MC3T3-E1稳定过表达LncRNADio3os细胞株.3.构建MC3T3-E1稳定敲除目的基因LncRNADio3os细胞株Bsmb1线性化LentiCRISPRV2质粒后,琼脂糖凝胶电泳图显示2条清晰的条带,大回收片段条带。表明成功线性化LentiCRISPRV2。挑选4-8个单克隆菌落扩大培养后提取质粒DNA,送至公司进行测序,将测序结果同设计的sgRNA引物进行比对。挑选含sgRNA的质粒进行后续实验。结果显示CRISPR/CAS9-gRNA载体的构建成功。收集包装病毒上清液感染目的细胞MC3T3-E1.转染48小时后,利用嘌呤霉素筛选1周后通过无限稀释得到的单克隆细胞株,通过PCR扩增验证。同野生型PCR产物对比,纯合子突变型的PCR产物大小符合预期大小。同时,切胶回收并送公司测序。将测序结果在NCBI网站进行序列比对。结果提示CRISPR/CAS9敲除全基因组LncRNA Dio3os全基因组成功。4.通过RT-qPCR检测在MC3T3-E1过表达和敲除LncRNA Dio3os后对成骨形成和分化的影响,结果显示:当过表达LncRNA Dio3os后,RUNX2和OCN表达水平表达减少。相反,当敲除LncRNA Dio3os后,RUNX2和OCN表达则显著增多。ALP染色结果显示:与野生型相比,过表达LncRNA Dio3os细胞组显示ALP染色减少,表明成骨的活性降低,成骨细胞分化受到抑制。而敲除LncRNA Dio3os则相反,ALP染色明显增多,表明成骨细胞的活性增强,成骨细胞的分化显著提高。5.通过RT-qPCR检测在MC3T3-E1过表达和敲除LncRNA Dio3os后对临近编码基因Dio3 mRNA影响,结果显示:随着LncRNA Dio3os过表达而明显增加,反之则依然。表明LncRNA Dio3os在成骨细胞中正向调控临近编码基因Dio3的转录。结论:1.在MC3T3-E1细胞株中,LncRNA Dio3os负向调控成骨细胞的形成和分化。2.在成骨细胞中,LncRNADio3os正向调控临近编码基因Dio3。