背景对于终末期肝病患者来说,现阶段最有效的治疗手段是肝脏移植,随着外科技术的不断改良和免疫抑制剂的更新换代,肝移植患者远期存活率有所提高,但临床上仍有一定比例的患者会出现围手术期风险和术后肝脏原发性失功的情况,这是肝移植研究领域亟待解决的难题。冷缺血是移植肝在低温运输保存期间不可避免的损伤过程,其病理生理过程与术后肝脏功能恢复及远期预后密切相关。现阶段,对于肝移植的研究大多注重于移植后肝脏的缺血再灌注损伤,对于肝脏冷保存过程中发生的损伤变化及机制缺乏更为细致全面的研究。目的本实验通过对小鼠移植肝进行不同时间点的冷保存,观察肝脏发生的病理学改变和超微结构变化,并对肝功能及其相关损伤指标,如AST、ALT、MDA、GS、HIF-1α、AQP8和KLF2及其下游基因eNOS进行检测。试图揭示移植肝随着冷保存时间的延长相继出现的损伤及其背后的分子机制,对深入了解移植肝冷保存损伤的变化过程及保存措施的研发有着重要的基础研究意义和临床应用价值。方法(1)建立小鼠肝移植冷保存动物模型:取健康的雄性C57BL/6小鼠20只,周龄:8周,随机分为4组。原位灌流摘取肝脏后,分别冷保存3个时间点:(1)正常对照组(Normal):未低温灌流、未冷保存,麻醉后小鼠直接取肝;(2)冷保存4h组(CS 4h):4℃UW液低温灌流后,4℃保存4小时;(3)冷保存12h组(CS 12h):4℃UW液低温灌流后,4℃保存12小时;(4)冷保存24h组(CS 24h):4℃UW液低温灌流后,4℃保存24小时。(2)留取肝脏行病理切片、HE染色、PAS染色和透射电镜观察肝脏形态学和超微结构改变及糖原分解情况;留取各时间点再灌流液,检测再灌流液中ALT、AST的含量;用Real-time PCR技术检测肝组织中MDA、GS、HIF-1α、KLF2及其下游eNOS的mRNA的表达水平。用western-blot技术检测肝组织中AQP8蛋白的表达水平。结果(1)冷保存过程中小鼠肝脏HE及电镜超微结构改变。小鼠肝脏HE改变:冷保存4小时后肝细胞未见明显损伤。冷保存12小时后部分肝细胞胞质水肿,表现为排列疏松,胞质淡染且染色不均,肝血窦裂隙增大。冷保存24小时后,肝细胞胞质水肿较前严重,排列紊乱,细胞形态异常,部分细胞核出现溶解破碎,肝血窦裂隙增大情况较前更严重。小鼠肝脏超微结构改变:(1)细胞核的变化:与正常对照组相比,不同冷保存时间点的肝细胞核相继出现核膜边界不清晰,形状不规则,异染色质边集,最终细胞核出现固缩,核仁消失。(2)线粒体的变化:冷保存4小时后,线粒体轻度肿胀,基质变淡。冷保存12小时后,线粒体中度肿胀,内室扩大,体积增大,基质电子密度降低,部分出现空泡化现象,部分嵴发生断裂、溶解。冷保存24小时后,线粒体重度肿胀,体积继续增大,部分变形为杆状长条形,嵴明显缩短甚至消失溶解,部分外膜发生破裂。(3)内皮细胞的变化:冷保存4小时和12小时后,内皮细胞并未发生明显损伤,当时间延长到24小时后,内皮细胞明显水肿,胞质内形成大量空泡,可见自噬小体,内皮细胞膜结构不完整且发生不同程度的变形等改变。(2)小鼠肝脏再灌流液中ALT、AST及肝组织中MDA含量变化:冷保存时间达到24小时后,小鼠灌流液中ALT活性显著升高;冷保存时间达到12小时后,小鼠灌流液中AST活性逐步升高。小鼠肝脏中的MDA含量同样随着冷保存时间的延长逐渐升高,表明各组小鼠肝脏均有不同程度的损伤。(3)小鼠肝组织切片糖原(PAS)染色结果:正常对照组糖原染色阳性率高,随着冷保存时间的延长,糖原染色阳性率下降,密度降低,分布不均匀现象出现。(4)冷保存肝组织中GS mRNA水平变化:随着冷保存时间的延长,小鼠肝脏GS mRNA表达水平逐渐降低。(5)冷保存肝组织中KLF2及eNOS mRNA水平变化:随着冷保存时间的延长,小鼠肝脏KLF2 mRNA表达水平逐渐降低,在冷保存24小时后,eNOS mRNA表达水平开始下降,在冷保存4小时和12小时时,eNOS mRNA表达水平未见明显改变。(6)冷保存肝组织中HIF-1αmRNA水平变化:冷保存4小时后,小鼠肝脏HIF-1αmRNA表达水平未见明显变化,冷保存12小时后,HIF-1αmRNA表达水平明显升高,冷保存24小时后,小鼠肝脏HIF-1αmRNA表达水平又有所下降。(7)冷保存肝组织中AQP8蛋白水平变化:随着冷保存时间的延长,小鼠肝脏中AQP8的蛋白表达水平逐渐降低。结论1.随着冷保存时间的延长,肝细胞、细胞核、线粒体、内皮细胞损伤相继出现并逐渐加重。肝细胞受损导致AST、ALT释放,自由基大量生产导致脂质过氧化MDA含量增加,肝糖原合成受损,分解增强。2.肝移植冷保存损伤可能始于线粒体,转录因子KLF2的下调加重了内皮的损伤,缺氧诱导因子HIF-1α表达上调可能在小鼠肝脏冷缺血损伤中发挥了潜在的保护作用。同时,AQP8的表达出现下调,提示可能会导致肝细胞水肿或与HIF-1α存在调控关系。