研究背景胶质瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤,具有高发病率及高死亡率的特点,其中胶质母细胞瘤恶性程度最高,平均生存期约一年。恶性胶质瘤治疗方法主要以外科手术切除为主,术后辅以放疗及化疗,但由于胶质瘤呈浸润性生长且对放化疗均不敏感,致使患者平均生存时间仍无较大改善。随着科学技术的发展,分子生物学及免疫学领域的不断进步,使得肿瘤免疫治疗成为一种很有前景的治疗模式,并且已成为手术治疗、放疗、化疗之后的第4种肿瘤治疗的手段。树突状细胞(Dendritic Cell, DC)是免疫系统最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell, APC),是特异免疫应答的始动者。树突状细胞是肿瘤免疫反应的关键环节,可有效提呈抗原并活化初始T淋巴细胞而产生抗肿瘤免疫反应。正常情况下,大多数树突状细胞以未成熟的状态存在于外周组织,表达低水平的表面共刺激分子、黏附分子,表达较多的FcR和病原体受体,具有极强的摄取和加工处理抗原的能力。未成熟树突状细胞摄取抗原后将其加工、处理为抗原肽,载入MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子形成抗原肽-MHC分子复合物并表达于树突状细胞的表面,同时上调树突状细胞表面共刺激分子、黏附分子的表达分化成熟树突状细胞。成熟树突状细胞可识别并激活肿瘤抗原特异性T细胞,同时树突状细胞分泌IL-12等细胞因子刺激T淋巴细胞增殖,产生肿瘤杀伤效应。目前,肿瘤抗原致敏树突状细胞后形成的树突状细胞疫苗已经应用于临床并取得了较好的疗效。树突状细胞疫苗的主要制备方法包括肿瘤抗原多肽致敏树突状细胞、肿瘤细胞提取的DNA或mRNA致敏树突状细胞、肿瘤细胞的蛋白提取物致敏树突状细胞、细胞因子或趋化因子基因修饰树突状细胞、树突状细胞与肿瘤细胞互相融合等。氩氦冷冻是近年来兴起的一种新的冷冻外科治疗手段,具有高效微创性、靶向性、病人痛苦少、费用低等优点,而且相对于液氮冷冻系统,使用氩氦冷冻系统具有冷冻速率快、冷热循环时间少、而且氦气复温能迅速阻止冰球进一步形成,减少对周围组织的损伤等优势,使得氩氦冷冻系统逐步在临床肿瘤治疗上得到就用。氩氦冷冻消融肿瘤后,局部大量组织坏死,这些坏死组织作为肿瘤抗原被未成熟树突状细胞摄取。未成熟树突状细胞分化成熟,并诱导T淋巴细胞活化增殖。冷冻损伤导致的细胞坏死,以细胞崩解和释放细胞内容物为特点。细胞内容物包括促炎细胞因子,一些被辨别为Toll样受体的分子如热休克蛋白、DNA和RNA,以及“危险信号”如尿酸和染色体蛋白HMGB1,它们都具有免疫刺激性,能够激活并促进免疫反应。此外,被破坏的组织结构如纤维蛋白原、低聚糖的透明质酸、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等,同样具有免疫刺激性。冷冻疗法不同于传统热疗,对肿瘤内部的抗原肽不会产生大的破坏。这些相对较完整的肿瘤特异性抗原随着肿瘤细胞的裂解被释放,易被体内抗原呈递细胞摄取并递呈给T淋巴细胞,从而产生细胞免疫效应。近年来大量体内外的实验研究证实,树突状细胞能有效摄取肿瘤组织冷冻消融后的产物后分化成熟,提高抗原递呈功能,并有效激活T淋巴细胞产生抗肿瘤免疫反应。因此,基于氩氦冷冻治疗肿瘤能提供大量原位抗原以及树突状细胞具有强大的摄取、提呈抗原能力,我们通过氩氦冷冻联合肿瘤内注射未成熟树突状细胞治疗荷胶质瘤小鼠,研究联合治疗后的抗肿瘤免疫效应。本研究选用C57BL/6小鼠及GL261胶质瘤细胞系作为研究对象,首先,利用GM-CSF、IL-4诱导培养未成熟骨髓源DC,流式细胞仪检测DC表面分子的表达。建立C57BL/6-GL261胶质瘤模型,氩氦冷冻治疗胶质瘤24h后瘤内注射未成熟DCs 106个,流式细胞仪检测冷冻外周血CD3+、CD4+、D8+ T细胞变化；ELISA冷冻治疗后血清IL-12含量；流式细胞仪检测冷冻治疗后脾脏淋巴细胞Thl/Th2;CCK-8法检测冷冻治疗后脾脏CTL毒性；70天后对幸存小鼠进行复种肿瘤,检测是否产生免疫记忆；肿瘤体积变化曲线；生存分析。目的：1.探讨建立体外大量扩增小鼠骨髓源未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell, imDC)的方法,为树突状细胞的胶质瘤免疫治疗提供细胞来源。2.氩氦冷冻联合肿瘤内注射未成熟树突状细胞治疗荷胶质瘤小鼠后的免疫效应。方法：制备小鼠骨髓细胞,应用GM-CSF (10ng/mL)、IL-4 (10ng/l nL)诱导培养未成熟DC,倒置显微镜观察其细胞形态学变化,于第5天收集半贴壁细胞进行流式细胞仪检测细胞表面标志物CDll、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表达。建立C57BL/6小鼠胶质瘤模型,荷胶质瘤小鼠随机分成4组,分别为空白对照组(n=14)、imDC组(n=14)、氩氦冷冻+PBS组(1=15)、氩氦冷冻+imDC组(n=15),流式细胞仪检测冷冻治疗前1天、冷冻治疗后第10天外周血CD3+、D3+CD4+、 CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的变化；ELISA检测冷冻治疗后第10天血清IL-12含量：流式细胞仪检测冷冻治疗后第10天脾脏淋巴细胞Thl/Th2; CCK-8法检测冷冻治疗后第10天脾脏细胞毒性T细胞毒性反应(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL);70天后对幸存小鼠进行复种肿瘤,检测是否产生免疫记忆；每3天用游标卡尺测量肿瘤最大长径(a)和最大宽径(b),计算肿瘤体积大小,绘制肿瘤大小变化曲线；荷胶质瘤小鼠生存分析。结果：利用GM-CSF和IL-4可以从C57BL/6小鼠骨髓细胞中诱导培养出DC,培养第5天细胞在形态上具有未成熟DC的典型特征。培养第5天未成熟DC的CD11c+、CD80+. CD86+及MHC-Ⅱ表达率分别为CDllc+(80.28±4.94%)、CD80+ (31.58±3.94%)、CD86+(28.31±6.08%),及MHC-II+(64.78±7.63%)。治疗后氩氦冷冻+imDC组肿瘤逐渐变小,与空白对照组、imDC组、氩氦冷冻+PBS组比较差异有统计学意义(P0.000)。以70天为观察期,观察期间内,空白对照组及imDC组死亡率为100%,空白对照组平均生存时间为(39.11±4.86)d,imDC组平均生存时间为(42.11±6.47)d；氩氦冷冻+PBS组有4只小鼠因肿瘤大小不规则致冷冻不完全而复发死亡,平均生存时间为(61.30±11.63)d；氩氦冷冻+imDC组无死亡,平均生存时间为(70)d(P=0.000)。治疗前,各组CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+细胞,以及CD3+CD4+/CD3+CD8+差别没有统计学意义(P=0.782,P=0.642,P=0.813,P=0.959)。治疗10天后,流式检测氩氦冷冻+imDC组外周血T淋巴细胞的表达：CD3+(50.65±4.42%), CD3+CD4+(32.90±3.76%) 以及 CD3+CD4+/CD3+CD8+(1.99±0.26)明显高于其它三组P=0.000；P=0.000；P=0.000)；氩氦冷冻+PBS组CD3+, CD3+CD4+细胞,以及CD3+CD4+/CD3+CD8+高于空白对照组(40.39±2.17%vs.35.24±1.55%,P=0.014；23.68±1.31%vs.18.48±1.15%,P=0.002；1.52±±0.11 vs.1.19±0.17,P=0.034).治疗后imDC组的CD3+, CD3+CD4+虽然也有所升高,但与空白对照组比较差异无统计学意义(38.57±2.77% vs.35.24±1.55%,P=0.092；21.36±1.79% vs.18.48±1.15%,P=0.060).另外,各组CD3+CD8+T细胞差异无统计学意义(P=0.547)。再且,治疗后氩氦冷冻+imDC组血清的IL-12水平(132.50±±7.16 pg/mL)明显高于空白对照组(37.22±9.16 pg/mL)-imDC组(68.82±6.23 pg/mL)、氩氦冷冻+PBS组(72.95±9.93pg/mL)(P=0.000)。氩氦冷冻+imDC组Thl表达水平(13.98+2.52%)在术后第10d显著高于其它三组,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。不同效靶比时氩氦冷冻+imDC组CTLs对GL261细胞的杀伤率显著高于空白对照组、imDC组、氩氦冷冻+PBS组,差异有统计学意义(P=0.000)。结论：1.利用GM-CSF和IL-4诱导培养并通过手法筛选初步纯化可以从C57BL/6小鼠骨髓细胞中获得较高纯度小鼠骨髓源未成熟树突状细胞,是一种简便经济的未成熟树突状细胞培养方法,为DC的肿瘤免疫治疗提供了细胞来源。2.在氩氦冷冻降低肿瘤负荷的基础上,联合原位注射未成熟DC能够有效利用冻融肿瘤细胞释放出的肿瘤抗原,体内完成DC抗原负载,诱导抗肿瘤特异性免疫反应,为氩氦冷冻免疫治疗胶质瘤提供了实验基础。