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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一种严重危害世界养猪业的传染性疾病。2012年开始,从我国养猪场分离到一类与2008年在美国分离到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV毒株,最近几年这类毒株在我国养猪场广泛发现,在我国命名为PRRSV类NADC30毒株。该类毒株具有中等致病力,有研究表明现有的商品化疫苗已经不能提供完全的保护,对我国养猪业造成一定的经济损失。因此,分析该类毒株的遗传演化及分子致病机理具有重要的意义。本论文在对PRRSV类NADC30毒株HNyc15分离鉴定的基础上,进行了分离毒株的全基因组序列测定和进化分析,以期探究该类毒株的变异规律;利用反向遗传操作技术,构建了类NADC30毒株HNyc15的感染性克隆,以期为开展该类毒株致病机理、变异机制等相关研究奠定基础。本研究对河南伊川猪场的血清样品进行PRRSV检测,检测结果显示为PRRSV阳性,且分型检测初步表明其为类NADC30毒株;利用猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)进行病毒分离,接种PAM细胞后48h可观察到典型的细胞病变,96h收获细胞培养物;对其做RT-PCR,扩增Nsp2基因片段进行序列测定,Nsp2基因测序结果比对显示,与NADC30毒株Nsp2区域有着相同的131个氨基酸缺失。因此,确定为类NADC30毒株,命名为HNyc15株。本研究根据Genbank上公布的NADC30毒株的全基因序列设计引物,对HNyc15毒株的全基因序列分为12段扩增,将各段基因序列测定结果进行拼接,基于国内外已有毒株的全基因组序列进行比对分析、遗传进化分析、重组分析。全基因序列测定表明,HNyc15毒株基因组全长为15049bp;与已报道的毒株全基因序列对比发现,HNyc15株与LV株、VR-2332株、NADC30株的核苷酸一致性分别为60.4%、85.2%、93.8%;进化分析表明,HNyc15、HENAN-XINX、HNjz15、HENAN-HEB、NADC30属于同一亚群,该亚群大多是由2012年之后在我分离到的类NADC30毒株所组成;软件分析重组情况表明,HNyc15株在ORF2-4区域重组了VR-2332和CH-1a的基因片段。由此推断,我国的类NADC30毒株可能是由美国NADC30株与美洲型毒株经历基因重组和逐渐积累变异而来的。本研究将PRRSV类NADC30毒株HNyc15基因组根据合适的酶切位点分为A、B、C、D、E、F六个片段,设计引物分段扩增,将扩增后的产物插入中间载体pEASY-Blunt simple构建中间质粒;在pBluescriptⅡSK(+)载体多克隆位点(MCS)的上游插入CMV真核启动子,下游引入用于提高转染效率的丁型肝炎病毒的核酶因子(HDV)及BGH终止信号序列,改造出转录载体pBlue-CMV-HB;利用各片段两端的单一酶切位点将六个片段连入改造后的转录载体pBlue-CMV-HB中构建全长cDNA克隆质粒pBlue-CMV-HNyc15,并在B、C片段连接处通过同义突变引入酶切位点XbaⅠ,作为感染性克隆的遗传标记。转染BHK-21细胞,48h后收获细胞培养上清接种PAM细胞,接种后48h可在显微镜下观察到明显的细胞病变。通过IPMA鉴定表明病毒拯救成功,酶切鉴定遗传标记存在于拯救病毒。比较亲本病毒与拯救病毒的多步生长曲线,表明HNyc15拯救病毒与其亲本病毒在PAM细胞上的增殖特性没有显著差异。以上结果表明PRRSV类NADC30毒株HNyc15株感染性克隆构建成功,为研究PRRSV类NADC30毒株的分子生物学以及致病机制提供了技术平台。