紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草,又称光瓣堇菜,为常用中草药。其性寒,味苦、辛,具有抗炎、抑菌、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)活性和调节免疫力等作用,临床适用于疔疮肿毒、红肿热痛、毒蛇咬伤等病症的治疗。而柴胡为伞形科多年生草本植物,是我国另一种传统中药,包括北柴胡Bupleurum chinense DC)和小叶黑柴胡(Bupleurum smithii var. parvifolium)等,具有抗炎及免疫调节作用。巨噬细胞起源于骨髓前体细胞,是广泛分布于全身的免疫细胞。巨噬细胞具有组织特异性,如肝脏中的枯否细胞、脑中的小神经胶质细胞,腹腔中的巨噬细胞、肺中的肺泡巨噬细胞以及骨中的破骨细胞等,是由巨噬细胞分别定位于不同组织而形成的。活化的巨噬细胞吞噬能力增强,可以直接通过吞噬或者通过分泌炎性细胞因子和NO等抗病原介质问接杀死病原体,有效防御因病原体侵害而引起的机体损伤,是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,在天然免疫中起重要作用。肠道黏膜免疫系统是指分布于机体胃肠道的肠道相关淋巴组织(GALT),包括派伊尔结、肠系膜淋巴结以及分散在黏膜固有层和肠上皮中的大量淋巴细胞,是产生免疫耐受的重要部分。通过激活肠道黏膜免疫产生的免疫耐受或者免疫抑制,是治疗自身免疫性疾病的可能途径之一。课题组前期研究结果表明：(1)紫花地丁石油醚部分对LPS诱导的急性肺损伤(ALI)小鼠有明显的治疗作用。(2)小鼠灌胃给予柴胡多糖可明显改善系统性红斑狼疮样综合征(SLE)小鼠的肾病理损伤,下调机体免疫亢进的表现。鉴于以上我们已有的药效学研究成果,在本实验中,我们观察紫花地丁石油醚部分的整体和离体的抗补体活性,以及对Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞以及传代巨噬细胞系RAW264.7细胞的活性以及分泌功能的影响,以进一步了解紫花地丁石油醚部分的抗炎免疫作用；此外,本研究观察了柴胡多糖对脾脏以及肠道相关淋巴组织的影响,采用空肠弯曲菌CJ-S131建立的SLE样小鼠模型,取脾细胞用该菌再度刺激,观察离体给药的药效,以深入探讨柴胡多糖可能的抗炎免疫作用机制。1紫花地丁的抗炎作用研究目的研究紫花地丁石油醚部分(PEVY)的抗补体活性以及对腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞细胞活性和分泌功能的影响。方法(1) PEVY抗补体活性测定：经典途径的补体溶血活性测定法测定PEVY的补体抑制活性。免疫组化法检测急性肺损伤小鼠肺部病理切片的补体C3c沉积。(2)PEVY对腹腔巨噬细胞和传代巨噬细胞系RAW264.7细胞活性和分泌的影响：巨噬细胞分为5组,正常对照组、二甲亚砜(DMSO)对照组、内毒素(LPS)刺激组、PEVY(1、10、50、100μg/ml)与LPS联合处理组、PEVY(1、10、50、100μg/ml)单独处理组。巨噬细胞给予不同药物作用24h。MTT法检测吸光度值。Griess法和酶联免疫吸附法(ELISA)法分别检测巨噬细胞在未受刺激及受LPS刺激下,PEVY对巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)和细胞因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的影响。结果(1) PEVY具有较强的抗补体活性,CH50=61±11μg/mL;整体上能明显减轻和改善ALI小鼠肺部补体沉积。(2)对腹腔巨噬细胞， PEVY单独作用时,随着剂量的增加可以促进其活化(P<0.001)；对RAW264.7细胞,紫花地丁石油醚部分在大剂量(50、100lμg/ml)时对细胞活性有抑制作用(P<0.01)；加入LPS刺激后,PEVY可进一步地促进腹腔巨噬细胞的活度(P<0.01),但却能抑制RAW264.7的活性(P<0.001)。PEVY可显著抑制这两种细胞由LPS引起的NO分泌水平的升高(P<0.001); PEVY单独作用时可显著促进两种巨噬细胞分泌TNF-α (P＜0.001),但对LPS刺激后巨噬细胞分泌TNF-α无明显抑制作用。结论(1)离体实验显示,紫花地丁石油醚部分具有很好的抗补体活性。并且口服给药,能明显减轻和改善急性肺损伤小鼠肺部补体沉积。离体抗补体活性实验和整体动物实验均能相互佐证紫花地丁石油醚部分具有良好的抑制补体过度激活作用活性。(2)对小鼠腹腔巨噬细胞和传代巨噬细胞RAW264.7,紫花地丁石油醚部分均能显著促进其TNF-α的分泌水平,但抑制NO分泌。提示其可能具有抗肿瘤活性。其对巨噬细胞活性的影响,与其促TNF-α水平存在一定关系。PEVY的补体过度激活的抑制作用,可能是其整体给药显示肺保护作用的关键所在。2柴胡多糖的抗炎作用研究目的研究柴胡多糖对正常小鼠脾脏和肠道相关淋巴组织的影响,同时探讨离体给药其对SLE样小鼠脾细胞分泌功能的影响。方法(1)柴胡多糖对正常小鼠脾脏和肠道相关淋巴组织的影响：Balb/c小鼠随机分为4组：正常对照组、ConA刺激组、Bps单独处理组、Bps与ConA联合处理组。小鼠脾脏、MLN和PP结分别给予不同药物作用48h。MTT法检测吸光度值。ELISA法检测Bps对脾细胞、MLN和PP结分泌IFN-γ和IL-10的影响。同时流式检测正常小鼠MLN和PP结中CD3+和CD4+的比例。(2)柴胡多糖对SLE样小鼠脾细胞的影响：建立CJ-S131诱导SLE样模型,day51处死小鼠,取脾细胞。细胞分为4组：正常对照组、CJ-S131刺激组、Bps(5、10、20、40、80μg/ml)与CJ-S131联合处理组、Bps单独(5、10、20、40、80μg/ml)处理组。小鼠脾细胞给予不同药物作用48h。ELISA法检测抗dsDNA抗体、IgG、IFN-γ、IL-10和IL-17等指标。(3)柴胡多糖对SLE样小鼠淋巴细胞比例的影响：动物分为正常组,佐剂对照组,模型组和给药组,分别制备脾脏和MLN的单细胞悬液。每组细胞均设CD3+单染、CD4+单染、CD3+CD19+双染和CD3+CD4+CD8+三染。加入相应的流式抗体,染色后上机检测。结果(1)Bps单独作用时,随着剂量的增大可显著促进脾细胞和MLN的增值活性(P<0.01)；ConA刺激后,与未加ConA对照组相比,细胞增值活性显著提高(P<0.001),而Bps各浓度均可显著抑制ConA引起的脾细胞和MLN的增值(P<0.001)。而Bps对PP结的无显著影响。柴胡多糖单独作用时,对脾脏和MLN分泌IFN-γ无显著影响；而经ConA刺激后,柴胡多糖可显著抑制脾脏和MLN的IFN-γ的分泌水平(P<0.001)。而对于IL-10分泌的影响,柴胡多糖单独作用可显著促进脾脏IL-10的分泌(P<0.001),但对MLN仅在大剂量可抑制IL-10的分泌；对经ConA刺激后的脾细胞,柴胡多糖可显著抑制升高的IL-10的分泌,但对于MLN仅在小剂量10μg/ml有抑制作用。(2)柴胡多糖能显著地降低模型组脾细胞由CJ-S131再刺激引起的抗dsDNA抗体和总IgG的高水平(P<0.001),并明显抑制各组IFN-γ和IL-10的分泌(P<0.001)。但柴胡多糖对于模型组的高水平的IL-17无显著影响。(3)与正常组相比,模型组的脾脏T细胞比例有降低趋势,而B细胞比例有所升高,但无显著性差异；而T细胞中Th细胞和Tc细胞的比例,各组间均无显著差异；与脾脏类似,模型组MLN中的T细胞比例有降低,而B细胞比例有升高趋势,但无显著性差异；而T细胞中Th细胞和Tc细胞的比例,各组间均无显著差异。与模型组相比,柴胡多糖给药组的脾脏和MLN的T细胞比例有降低趋势,而B细胞比例有所升高,但均无显著性差异；而T细胞中Th细胞和Tc细胞的比例,组间无显著性差异。结论(1)柴胡多糖口服除了通过中枢淋巴器官脾脏外,可能还通过肠道粘膜免疫系统中的肠系膜淋巴结发挥其抗炎作用,两者对于柴胡多糖的反应是类似的。柴胡多糖对于发挥肠道局部免疫效应的PP结无显著影响,这可能提示我们研究柴胡多糖对肠道免疫的影响可能需更多关注小肠粘膜上散在的淋巴细胞。(2)CJ-S131再刺激疾病模型鼠脾脏细胞,可有模拟整体病变的表现,如抗dsDNA抗体和总IgG水平的升高,SLE相关细胞因子(IFN-γ、IL-10和IL-17)水平的上升。离体柴胡多糖可显著降低SLE样炎症模型的抗dsDNA抗体和总IgG的水平,同时其能有效抑制SLE相关细胞因子IFN-γ和IL-10水平,而对IL-17水平无显著影响。这提示柴胡多糖治疗SLE的作用靶点可能不在Th17细胞。(3)柴胡多糖可能并不是通过影响脾脏淋巴细胞数量比例而发挥治疗SLE的药效的,而有可能是通过影响淋巴细胞的功能,如分泌SLE相关的细胞因子(IFN-γ和IL-10)发挥疗效。