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肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率和发病率均居癌症首位。根据世界卫生组织调查显示,肺癌已成为全世界死亡率和发病率最高的恶性肿瘤。目前,肺癌患者的五年生存率不足15%,导致肺癌患者死亡的主要原因是肿瘤的侵袭和转移。近年来研究发现,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition EMT)是肺癌发生转移的一个重要原因,EMT能通过改变肿瘤细胞特性和肿瘤细胞生存的微环境来增强肿瘤的侵袭性和转移性,因此,EMT在肿瘤的侵袭和转移过程中起重要作用,其具体机制揭示预防肿瘤复发和开发新抗肿瘤治疗靶点药物均具有重要意义。PTEN (phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10)是最早发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因,在多种进展期和转移性肿瘤(非小细胞肺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、脑癌、前列腺癌等)中发生高频率缺失和突变。PTEN信号途径在肿瘤细胞发生EMT过程中发挥重要的作用,靶向抑制PTEN信号途径诱导的EMT作为治疗肿瘤的一个新的策略。一、文献研究查阅相关古今文献,从中医药抗肿瘤转移文献研究、活血化瘀治则抗肿瘤转移的研究以及丹参和丹酚酸A抗肿瘤转移的研究三个方面对中医药抗肿瘤转移研究进行了较为系统的综述；从肿瘤上皮间质转化和PTEN信号通路抑制肿瘤转移研究两个方面对现代抗肿瘤转移的信号通路进行了深入地探讨,为论文制定切实可行的研究方案,确定研究考察指标及研究起点奠定了基础。二、实验研究(一)丹酚酸A对肺癌上皮间质转化(EMT)的影响1.丹酚酸A对TGF-β1诱导的肺癌EMT细胞形态学的影响。以肺癌A549细胞为研究对象,应用TGF-β1为EMT诱导剂,采用显微镜观察法研究了研究了丹酚酸A对TGF-β1诱导的肺癌EMT细胞形态学的影响。结果显示丹酚酸A能逆转细胞发生间质化转变,细胞以上皮细胞形态为主,少数细胞呈梭形,细胞间粘附性增加。提示,丹酚酸A能抑制肺癌发生EMT的形态学改变。2.丹酚酸A对TGF-β1诱导的肺癌EMT细胞迁移侵袭的影响。采用细胞划痕实验和实时无标记细胞分析系统Real-time Cell Analysis (RTCA)检测丹酚酸A对TGF-β1诱导的肺癌EMT细胞迁移侵袭的影响。细胞划痕实验结果显示丹酚酸A能显著抑制TGF-β1诱导的肺癌细胞迁移(P<0.05),且呈时间依赖性；细胞侵袭实验结果显示丹酚酸A能显著抑制TGF-β1诱导的肺癌细胞侵袭(P<0.05),且呈时间依赖性。提示,丹酚酸A能抑制肺癌EMT细胞的侵袭和迁移。3.丹酚酸A对TGF-β1诱导的肺癌EMT标志物mRNA和蛋白表达的影响。采用Q-PCR法、免疫荧光高内涵法以及western blot法检测丹酚酸A对TGF-β1诱导的肺癌EMT标志物mRNA和蛋白表达水平的影响。Q-PCR结果显示丹酚酸A能显著增加E-钙黏蛋白(E-cad)的表达(P<0.01)、显著降低纤维连接蛋白(Fibronectin) (P<0.01)和波形蛋白(Vimentin) (P<0.01) mRNA水平的表达；免疫荧光高内涵法结合western blot法检测结果显示丹酚酸A能显著增加E-cad蛋白水平的表达(P<0.01)、显著降低Fibronectin (P<0.01) 和Snail(P< 0.01)蛋白水平的表达。提示,丹酚酸A能上调肺癌EMT细胞上皮表型标志物E-cad mRNA和蛋白水平表达,下调肺癌EMT细胞间质表型标志物Fibronectin和Vimentin mRNA和蛋白水平表达,以及下调负调控E-cad蛋白的转录因子Snail蛋白水平表达。4.丹酚酸A对TGF-β1诱导的肺癌EMT细胞骨架的影响。采用免疫荧光高内涵法检测丹酚酸A对TGF-β1诱导的肺癌EMT细胞骨架的影响。结果显示,丹酚酸A能显著降低细胞骨架微丝条数(P<0.01)和细胞骨架面积(P<0.01),并抑制细胞骨架微丝重排。提示,丹酚酸A能抑制肺癌EMT细胞骨架重排,从而抑制肺癌发生EMT。(二)从PTEN蛋白和PTEN信号通路研究丹酚酸A影响肺癌上皮间质转化的分子机制。1.丹酚酸A对肺癌EMT细胞中PTEN磷酸化水平的影响。采用免疫荧光高内涵法结合纳米级超微量蛋白分析系统(Nanopro)检测丹酚酸A对肺癌EMT细胞中PTEN磷酸化水平的影响。结果显示,丹酚酸A能显著上调肺癌EMT细胞中PTEN磷酸化水平(P<0.01),提示,丹酚酸A可能是通过上调PTEN磷酸化水平来抑制肺癌EMT的。2.丹酚酸A对肺癌EMT细胞中PTEN信号通路的影响。采用纳米级超微量蛋白分析系统(Nanopro)检测丹酚酸A对肺癌EMT细胞中PTEN信号通路的影响。结果显示,丹酚酸A能显著抑制PI3K/AKT信号通路,对FAK/P130cas和SHC/MEK/ERK1/2信号通路抑制作用不显著。提示,丹酚酸A通过抑制PI3K/AKT信号通路来抑制肺癌EMT,从而抑制肺癌的转移的。3.应用PTEN抑制剂BPV和siRNA-PTEN干扰技术后丹酚酸A对肺癌EMT细胞侵袭迁移和EMT标志物影响。应用PTEN抑制剂BPV和siRNA-PTEN干扰技术检测结果显示PTEN抑制和干扰后,丹酚酸A对肺癌EMT上皮表型标志物E-cadherin蛋白上调能力减弱,且对肺癌EMT细胞侵袭迁移的能力减弱。提示,丹酚酸A通过上调PTEN蛋白、抑制PI3K/AKT信号通路抑制肺癌EMT和肺癌细胞侵袭迁移。(三)丹酚酸A与PTEN蛋白的相互作用、结合后效应以及结合位点。1.丹酚酸A和PTEN蛋白的相互作用和亲和力。采用原核表达载体构建和表达His-PTEN融合蛋白,采用蛋白质中压层析系统纯化His-PTEN融合蛋白,采用Octet分子间相互作用仪检测丹酚酸A和PTEN蛋白的相互作用和亲和力。结果显示,丹酚酸A与PTEN蛋白有相互作用且亲和力较强(KD=7.63×10-7)。提示,丹酚酸A与PTEN蛋白具有较强的结合。2.丹酚酸A和PTEN结合后效应。采用GENMED-PTEN蛋白磷酸酶活性检测试剂盒检测丹酚酸A和PTEN结合后效应。结果显示,丹酚酸A与PTEN蛋白结合后能显著促进PTEN磷酸酶活性(P<0.05)。提示,丹酚酸A与PTEN蛋白结合后促进PTEN磷酸酶活性,明确了丹酚酸A和PTEN结合后效应。3.丹酚酸A与PTEN蛋白的结合位点预测。采用GLIDE反向分子对接技术预测丹酚酸A与PTEN蛋白的结合位点。结果显示,丹酚酸A可能与PTEN蛋白的S4结合口袋处结合,结合后会减弱C2域对Ptase域结合细胞膜的抑制效应,提高PTEN水解产物的产生量。因此推断,丹酚酸A与PTEN蛋白具有较强的亲和力,且结合后促进PTEN磷酸酶活性,原因可能是丹酚酸A与PTEN蛋白的S4结合口袋处结合,结合后会减弱C2域对Ptase域结合细胞膜的抑制效应,提高PTEN水解产物的产生量,从而促进PTEN蛋白磷酸酶活性,进而抑制PI3K/AKT信号通路,发挥抑制肺癌EMT以及肺癌的侵袭迁移。