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萜类化合物是生物维持正常生命活动所必需的一类天然烃类化合物。在自然界中,所有萜类化合物都经共同的中间体异戊二烯焦磷酸(IPP)及其异构物二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP)合成。IPP和DMAPP在绝大多数细菌、藻类和高等植物质体中由2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP)合成,然而在古细菌、真菌、动物体内则由甲羟戊酸途径(MVA)合成。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)是MEP途径中的第一个限速酶,因此可以作为靶标筛选抗生素和除草剂。DXS具有转酮酶活性,可以催化丙酮酸(Py)和3-磷酸甘油醛(D-GAP)生成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)。在本课题组的研究中发现,DXS还具有磷酸丙糖异构化活性,可以催化D-GAP和磷酸二羟丙酮(DHAP)间的异构化反应。为了更深入地了解DXS的催化机理,有必要对DXS催化活性的关键氨基酸残基进行识别。定点突变技术是蛋白质工程中的一项重要技术,可以通过改变蛋白质编码基因的碱基序列,研究酶活性部位的关键氨基酸残基。通过分析DXS的晶体结构,选取了六个可能的E. coli DXS催化活性关键氨基酸残基,分别是Asp427、Tyr392、His49、Arg478、His257、His299。首先通过定点突变的方法获得了突变基因,再经诱导表达及纯化得到6个DXS的突变体。使用纸色谱法和柱前衍生-高效液相色谱法对野生型和突变体的活性进行检测分析。Y392K转酮酶活性完全失活；D427K与野生型相比丧失60%的转酮酶活性；H257Q、R478A及H299D的转酮酶活性减弱,但随着反应时间的增加,反应仍可以彻底进行；H49Q转酮酶活性没有明显变化。与野生型相比,H299D、Y392K、H299D、Y392K、H49Q、H257Q、D427K及R478A的磷酸丙糖异构化活性变化较小。我们还利用酶联紫外法测定了所获得的DXS突变体的稳态动力学参数。与野生型相比,H49Q、D427K的Km值增大,表明这两个突变体对底物D-GAP的亲和力降低；H257Q、H299D、R478A的Km值减小,对底物D-GAP的亲和力增加。H257Q、H299D、R478A的kcat值降低,表明突变体的催化效率降低；H49Q、D427K的kcat值升高,表明突变体的催化效率升高。