【摘 要】
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背景:非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,多数患者确诊时已属晚期,传统疗法难以显著延长病人的生存周期;嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcell,CAR-T)技术通过DNA重组使T细胞精准靶向肿瘤,近些年取得了巨大突破;由于细胞间质上皮转换因子(ce
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背景:非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,多数患者确诊时已属晚期,传统疗法难以显著延长病人的生存周期;嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcell,CAR-T)技术通过DNA重组使T细胞精准靶向肿瘤,近些年取得了巨大突破;由于细胞间质上皮转换因子(cellular-mesenchymalepithelialtransitionfactor,c-Met)多见于肝脏、卵巢、胃、肺等多种实体肿瘤细胞表面,而在正常组织细胞表面低表达或不表达,因此c-Met是一个有较高应用价值的肿瘤靶向治疗分子。综上,靶向c-Met的CAR-T细胞在治疗实体瘤方面具有较大的研究潜力。目的:构建靶向c-Met的CAR-T细胞,在体外验证其靶向杀伤NSCLC的能力;建立裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察靶向c-Met的CAR-T细胞在体内抑制A549细胞移植瘤的有效性和安全性。方法:1、将含c-Met抗体scFv片段的CAR序列插入慢病毒质粒中,包被慢病毒。用酶切质粒电泳,检测目的基因正确性;利用倍比稀释后的慢病毒感染HEK293T细胞的阳性率计算病毒滴度;通过慢病毒感染的方式制作c-MetCAR-T细胞,用RetroNectin提高感染效率,感染体系中按MOI值=5添加慢病毒,感染体系:1×10~6/mLT细胞、病毒、促感染试剂transA;通过qPCR、weasternblot验证CAR序列的表达。通过流式细胞术检测c-MetCAR-T细胞的阳性率、细胞亚型。2、通过流式细胞术验证NSCLC细胞A549和H1975中c-Met蛋白的阳性表达和卵巢癌细胞株A2780中c-Met蛋白的阴性表达。利用A549细胞提供c-Met抗原,刺激c-MetCAR-T细胞,采用CCK-8法评估其扩增速度,以A2780细胞设立Nontarget对照;采用LDH释放法检测c-MetCAR-T细胞、活化T细胞在效靶比为1:1、1:5、1:10、1:20时对A549、H1975细胞的杀伤作用,以A2780细胞设立Nontarget对照;ELISA检测c-MetCAR-T细胞和活化T细胞在靶抗原刺激下,细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的释放情况,以A2780细胞设立Nontarget对照。3、使用荧光素酶标记的A549细胞按3×10~6/只的数量注射到裸鼠皮下,成瘤后分别给予c-MetCAR-T细胞、活化T细胞和PBS三种治疗,通过肿瘤体积、重量测量结合肿瘤体内成像评估c-MetCAR-T细胞于体内对NSCLC的抑制作用。对裸鼠肝、脾、肺、肾四种脏器进行HE染色,评估c-MetCAR-T细胞在体内是否会出现脱靶毒性;剥离瘤体,通过Tunel染色法检测肿瘤组织中靶细胞凋亡、免疫组化的方式检验肿瘤组织中增殖蛋白的表达和靶抗原c-Met蛋白的表达。结果:1、成功合成c-MetCAR慢病毒重组质粒,经酶切后监测电泳条带,结果提示条带位置符合理论值;基因测序结果符合原设计序列,并成功包装慢病毒;Westernblot和qPCR结果提示结果显示:CAR分子存在于慢病毒感染后的T细胞中,c-MetCAR-T细胞构建成功;流式细胞术测得c-MetCAR-T细胞阳性率可达38.4%,且在慢病毒感染过后CD8~ T细胞比例有所上调。2、经流式细胞术验证,NSCLC细胞A549、H1975均有较强的c-Met蛋白表达,可作为靶细胞,卵巢癌细胞A2780c-Met蛋白表达阴性,可作为Nontarget对照;CCK-8实验结果提示,在靶抗原的刺激下c-MetCAR-T细胞的数量较对照组上升更快(p
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