论文部分内容阅读
目的：研究Rac1GTP酶的活化对白血病细胞抵抗药物杀伤、周期、和归巢等干性特征的影响。
方法：用构建的Rac1组成活化型慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-Rac1-V12、Rac1负显性抑制型慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-Rac1-N17以及慢病毒空载体pCDH-MCS1-EF1-copGFP分别转染KG1a细胞；流式细胞仪技术检测VP16对三种KG1a处理24h和48h后的细胞凋亡情况；流式细胞仪技术检测三种KG1a细胞的G0期细胞比例的差异；流式细胞仪技术检测用Rac1特异性抑制剂NSC23766对KG1a细胞处理4天后，细胞G0期比例的变化；将三种KG1a细胞分别尾静脉注射到亚致死剂量照射过的NOD/SCID小鼠体内，16h后用流式细胞仪技术检测骨髓中三种细胞的归巢能力；对小鼠的骨髓切片进行免疫组化染色，以观察白血病细胞在骨髓中的定位情况；实时定量PCR技术检测G0期相关基因的mRNA在三种KG1a细胞中的表达差异；免疫荧光共聚焦技术观察相关分子在细胞中的表达；将三种KG1a细胞分别与成骨细胞共培养，检测细胞G0期比例。
结果：在VP16处理细胞24h和48h后，感染Rac1负显性抑制型慢病毒载体的KG1a细胞(Rac1-N17-KG1a)早期凋亡和晚期凋亡的比例显著高于感染Rac1组成活化型慢病毒载体的KG1a细胞(Rac1-V12-KG1a)(P＜0.05);Rac1-V12-KG1a细胞的G0期细胞比例最高，而Rac1-N17-KG1a细胞的G0期比例最低，三者的G0期比例相比具有显著性差异(P＜0.05);Rac0特异性抑制剂处理的KG0a细胞随着抑制剂浓度的增加，G0细胞比例显著下降(P＜0.05);Rac1-V12-KG1a细胞的归巢能力要显著高于Rac1-N17-KG1a细胞(P＜0.05)；通过免疫组化染色观察到KG1a细胞主要定位在成骨细胞区；通过实时定量PCR检测发现，N-Cadherin、Tie-2和c-MPL三种基因的mRNA表达水平在Rac1-V12-KG1a细胞中显著高于Rac1-N17-KG1a细胞(P＜0.05)，免疫荧光共聚焦显微镜观察确定三种分子的蛋白表达与mRNA表达趋势一致；与成骨细胞共培养后G0期细胞比例趋势与未共培养的相一致，三组细胞G0期细胞比例均有明显上升(P＜0.05)，
结论：Rac1GTP酶的活化能够通过上调N-Cadherin、Tie-2和c-MPL三种基因的表达，提高白血病细胞在骨髓中的归巢能力，增加休眠期细胞的比例，导致白血病细胞对化疗药物的抗药性增强；也能够直接提高白血病细胞的休眠期细胞比例，增强白血病细胞对化疗药物的抗药性。