牙胚条件液诱导脐带间充质干细胞向成牙本质细胞分化的实验研究

来源 :哈尔滨医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chongyou2025
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目的:从胎儿脐带组织中采纳组织块贴壁培养法分离人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs),并对其进行培养、生物学特性进行鉴定。用酶消化法提取大鼠幼仔牙胚细胞,利用牙齿发生、发育所需要的生长因子,制备牙胚细胞条件培养基(tooth germ cells conditioned medium,TGC-CM),在体外利用牙胚细胞条件培养基诱导HUC-MSCs,探讨其向牙源性组织分化的可能性,为HUC-MSCs牙向分化提供实验依据,为组织工程化牙齿研究提供可能的种子细胞。  方法:首先依据酶消化法,用Wista仔鼠的牙胚组织团块培养分离并提取牙胚细胞,通过检测牙胚细胞中成釉蛋白(AMBN)和波形丝蛋白(Vimtin)的免疫荧光表达对培养的细胞进行鉴定。其次采用组织块贴壁法从脐带组织中提取的华尔通氏胶中分离培养HUC-MSCs;观察原代以及传代后HUC-MSCs的细胞形态;流式细胞仪检验HUC-MSCs的细胞免疫表型和分析HUC-MSCs细胞增殖周期;用茜素红、油红O和免疫荧光染色分别鉴定HUC-MSCs的合成骨组织、合成脂肪组织、合成神经组织的能力。最后用生长良好的第3代(P3) HUC-MSCs在TGC-CM诱导下,检测其增殖能力,ALP的活性以及矿化结节的形成;用聚合酶链式反应(PCR)检测诱导后的HUC-MSCs里牙本质涎磷蛋白(DSPP)以及牙本质基质蛋白(DMP-1)的DNA扩增结果;检测诱导后的HUC-MSCs中DMP-1和牙本质涎蛋白(DSP)的免疫荧光的表达。  结果:(1)原代培养的牙胚细胞在显微镜下呈多角形细胞和梭形细胞两种细胞形态;免疫荧光检测显示AMBN和Vimtin呈阳性。(2)传代的培养的HUC-MSCs呈现出典型的成纤维细胞样形态,经流式细胞分析仪分析显示,HUC-MSCs表达造血细胞表面标志物CD34和CD45的可能的比率仅分别为0.73%和1.63%,而间充质干细胞表面标志物CD73、CD105、CD90的表达比率则分别为91.19%、96.12%和95.33%。HUC-MSCs在成脂肪诱导液中培养3周后,胞浆内可见油红O染色呈阳性的脂质形成;成骨诱导3周后细胞胞浆内产生对茜素红染色呈阳性的钙化结节;成神经诱导液培养10d后, nestin检测显示HUC-MSCs胞浆内可见绿色的免疫荧光且细胞呈神经细胞多角分枝样细胞形态。(3)诱导后HUC-MSCs的ALP活性、增殖能力与对照组相比均有显著升高(P<0.05); PCR结果显示诱导后HUC-MSCs表达DSPP基因和DMP-1基因,以及对DMP-1、DSP的免疫荧光检测呈阳性,表明分离培养出的HUC-MSCs是具备成牙本质功能。  结论:HUC-MSCs具有增殖能力,可体外培养,与间充质干细胞的表面标记物高度相近,而与造血干细胞表面标志物不吻合,同时具备间充质干细胞多向分化的特性;在牙胚细胞条件培养液诱导下,脐带间充质干细胞能被诱导具备成牙本质细胞功能。
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