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第一部分ADSCs的培养和鉴定目的：研究大鼠和犬ADSCs的生物学特性及最佳培养条件。方法：采用酶消化法分离培养大鼠和犬腹股沟脂肪组织来源ADSCs,光镜观察细胞形态,流式细胞仪检测表面抗原,CCK-8法检测细胞增殖能力,诱导大鼠ADSCs成脂和成骨分化,油红-O染色和碱性磷酸酶染色检测成脂和成骨分化能力,RT-PCR检测高糖和低糖培养条件下及不同代数大鼠ADSCs转录因子Oct-4和Sox-2的表达。结果：大鼠ADSCs为短梭形或三角形,犬ADSCs为长梭形。表面抗原CD29、 CD44和CD73呈阳性表达,CD34和CD14呈阴性表达,大鼠和犬ADSCs的表面抗原表达未见明显差异。犬和大鼠ADSCs具有体外增殖能力,群体倍增时间未见明显差异。大鼠ADSCs在诱导培养液条件下可成脂分化和成骨分化,油红-O染色见和碱性磷酸酶染色阳性。低糖培养条件下ADSCs的Oct-4mRNA和Sox-2mRNA表达水平明显高于高糖组。第3代（P3）ADSCs的Oct-4mRNA的表达水平明显高于P10和P20的ADSCs, Sox-2mRNA的表达在P20时明显下降。结论：成功分离培养具有多向分化潜能的ADSCs。体外培养ADSCs时低糖更有利于多向分化潜能的维持。ADSCs的分化潜能随着传代次数的增加逐渐下降。第二部分构建携带人TBX18基因的腺病毒载体并转染ADSCs目的：将携带TBX18的腺病毒载体转染大鼠ADSCs,观察转染效率。方法：构建携带人TBX18的腺病毒载体。将携带TBX18和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的腺病毒载体转染大鼠ADSCs,对照组转染携带GFP的腺病毒。以不同感染复数（multiplicity of infection, MOI）转染ADSCs,转染的MOI值分别为0、10、20、50、80、100和1000。转染后48小时观察细胞形态和绿色荧光表达。转染48小时后流式细胞仪检测转染效率。CCK-8法检测转染和未转染的ADSCs的增殖能力。RT-PCR检测ADSCs转染后48小时和7天TBX18的表达。结果：成功构建腺病毒载体pAd-MCMV-GFP-TBX18 （Ad-TBX18）,对照组为Ad-GFP。转染48小时后荧光显微镜观察可见随着MOI值升高,绿色荧光表达逐渐增强,MOI达到80可见部分绿色荧光细胞死亡,胞浆出现空泡。MOI达到1000大部分细胞发生漂浮死亡。MOI=50时TBX18转染效率为75.7±5.6%。RT-PCR检测显示ADSCs转染48小时和7天后TBX18mRNA的表达明显高于对照组。结论：成功构建携带人TBX18基因的腺病毒载体。转染ADSCs的最佳MOI值为50。转染后TBX18可在ADSCs中稳定表达。第三部分TBX18在心肌微环境中诱导ADSCs向起搏样细胞分化目的：研究在心肌微环境中TBX18对ADSCs分化的影响。方法：将转染Ad-TBX18和Ad-GFP的ADSCs与乳鼠心肌细胞以1：5或1：10的比例直接接触共培养,显微镜观察共培养体系中合胞体和单个细胞的搏动频率。RT-PCR检测共培养体系中HCN4mRNA、CX43mRNA和CX45mRNA表达。WB检测共培养体系和乳鼠心肌细胞的HCN4表达。共培养1周后免疫荧光检测CTNI、HCN4、CX43、CX45表达。共培养后5-7d后用全细胞膜片钳技术检测绿色荧光细胞的If电流,膜片钳检测前给予2-APB阻断细胞间电传导。结果：共培养7天后转染的ADSCs与乳鼠心肌细胞合胞体形成同步搏动,共培养后第5天GFP和TBX18组中合胞体最大搏动频率分别为75次/分和60次/分,第6天分别为60次/分和90次/分,第7天分别为60次/分和88次/分。TBX18组共培养5-7天后单个绿色荧光细胞搏动频率30～60次/分。共培养7天后免疫荧光法检测GFP组和TBX18组心肌特异性标志物CTNI的阳性表达率未见明显差异（28.6±5.8%vs 26.6±5.9%）。共培养后TBX18组HCN4mRNA的表达明显高于GFP组,HCN4蛋白水平显著高于GFP组和单纯乳鼠心肌细胞组。免疫荧光检测发现TBX18共培养组有HCN4表达阳性的绿色荧光细胞,阳性表达率为13±5%,GFP组没有HCN4的表达。RT-PCR分析显示TBXl 8组CX45mRNA的表达明显高于GFP组,CX43mRNA的表达明显低于GFP组。免疫荧光检测发现TBX18共培养组有CX43和CX45的表达。TBX18转染的ADSCs检测到If样内向电流,If样内向电流最大电流密度为5.43±1.36pA/pF,内向电流能被If电流的特异性阻滞剂CsCl完全抑制,GFP转染的ADSCs未检测到If群内向电流。结论：TBX18在心肌微环境中可以诱导ADSCs向起搏样细胞分化,提高起搏样细胞的分化效率。第四部分TBX18转染的ADSCs植入完全性房室传导阻滞的犬模型目的：将TBX18转染的ADSCs植入完全性房室传导阻滞的犬模型,进行在体起搏功能的验证。方法：共6只犬,植入VVI起搏器后行房室结射频消融术。Ad-TBX18转染犬ADSCs,48小时后制成细胞悬液,每只犬给予的细胞数量为1×107。3只犬用可操控的注射导管经股静脉注射Ad-TBX18转染的ADSCs的细胞悬液,注射部位为室间隔上部心肌。1只犬开胸注射Ad-TBX18转染的ADSCs,注射部位为室间隔基底部心外膜心肌。2只为对照组,仅进行VVI起搏器植入加房室结消融术。记录术后7天和14天心率。结果：犬ADSCs成功转染Ad-TBX18。6只犬行起搏器植入术,并成功构建完全性房室传导阻滞模型。1支犬开胸注射TBX18-ADSCs,术后1天死亡。经股静脉注射TBX18-ADSCs组术后1周和2周平均心率与对照组无明显差异。5只犬在消融后即刻、术后1周和2周心率无明显变化。术后心率40～50次／分。取材发现消融部位。右心室组织冰冻切片未见绿色荧光细胞。结论：TBX18转染的ADSCs植入完全性房室传导阻滞的犬模型后心率未见明显提高。进一步探索犬ADSCs转染TBX18后向起搏样细胞分化的条件,进行后续研究证实其在体起搏活性。