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生长抑素(Somatostatin,SS)是生长激素(Growth hormone,GH)的主要负性调控因子,与动物的生长及多种生理功能有关。SS的多种生物学功能是通过与G蛋白偶合的5种不同亚型的生长抑素受体(Somatostatin receptor,SSTR)而实现的。5中亚型中,SSTR2是猪垂体细胞抑制GH合成与分泌的主要受体。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发展起来的一种降低目的基因表达的技术。本研究拟通过设计SSTR2的shRNA,下调其表达,进而减弱SS的作用,达到促动物生长的目的。
本研究首先在Genbank中得到猪SSTR2的mRNA序列,利用Primer5设计引物,并在猪垂体RNA反转录cDNA中克隆得到该基因,并且成功构建猪SSTR2的真核表达载体SSTR2-pcDNA3.1(-);运用siRNA在线软件siRNA Target Finder设计猪SSTR2干扰靶点和三条shRNA的序列。用人工合成的方法合成DNA序列,进行退火,与慢病毒干扰质粒LV-shRNA-GFP连接,构建RNA干扰表达载体(LV-shRNA1、LV-shRNA2、LV-shRNA3)。提取并纯化质粒,用SSTR2-pcDNA3.1(-)和LV-shRNA质粒共转染CHO细胞系,用荧光定量PCR(Q-PCR)来检测SSTR2基因表达。;同时,对细胞裂解液中SSTR2蛋白含量进行检测,以确定干扰结果。结果表明,在细胞水平,三条shRNA可以明显下调SSTR2 mRNA的水平,干扰效率分别为:90.4%、28.3%、86.3%,其中,shRNA1使细胞裂解液中的SSTR2降低了33.3%。本研究成功的筛选到了猪SSTR2的shRNA,为利用shRNA下调动物SSTR2的表达打下基础。