第一部分IL-1α表达系统的构建目的:IL-1α基因的N端含有核定位序列,能够进入细胞核,但入核型IL-1α具体功能机制并不清楚。研究表明白血病细胞中IL-1α水平异常升高。为了探寻入核型IL-1αpropiece在白血病细胞中的生物学功能以及可能的调控机制,为IL-1α的入核功能的研究提供实验基础。方法:利用PCR方法克隆IL-1αpropiece基因,经过测序验证之后连接到慢病毒载体。其中包含带有FLAG标签与strep标签的IL-1αpropiece,用于对propiece进行定位与纯化。非标签IL-1αpropiece用于减少标签蛋白对蛋白功能最少程的影响。度包装慢病毒颗粒对jurkat细胞进行感染,利用流式细胞仪技术分选出高表达IL-1αpropiece的细胞。分离细胞浆蛋白与细胞核蛋白,使用免疫印迹的方法对不同组分中标签蛋白进行检测,从而对IL-1αpropiece的表达空间进行质控。免疫荧光也被用来对IL-1αpropiece的核定位进行质控。细胞核被分离出来,经过免疫荧光染色使用流式细胞仪进行检测。对整个细胞进行免疫荧光染色后,共聚焦检测标签蛋白在细胞中的定位。结果:入核型IL-1α克隆至慢病毒表达载体,成功包装出病毒颗粒,流式分选感染慢病毒后高表达GFP的细胞。细胞胞浆蛋白与核蛋白中对标签蛋白的免疫印迹表明IL-1αpropiece存在于细胞核组份中。共聚焦检测发现IL-1αpropiece与DAPI的信号出现共定位。而在对染色后的细胞核流式染色中,发现IL-1αpropiece组的平均荧光强度高于对照组。结论:成功制备高表达IL-1αpropiece的jurkat细胞。免疫印迹实验、共聚焦显微镜及细胞核的流式染色均表明propiece定位表达于细胞核中。IL-1αpropiece真核过表达平台构建成功。第二部分IL-1α在急性淋巴细胞白血病细胞系中的生物学功能目的:研究在急性淋巴细胞白血病细胞系过表达IL-1αpropiece对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响。研究低血清生存压力胁迫下及抗肿瘤药物顺铂毒性下,过表达IL-1αpropiece在急性淋巴白血病细胞中的生物学作用。方法:在过表达IL-1αpropiece的急性淋巴白血病细胞系中MTT法检测24、48,72小时细胞增殖情况,并检测低血清生存胁迫与顺铂药物毒性下的细胞增殖情况。Annexin V与7AAD双染检测IL-1αpropiece过表达对细胞凋亡的影响。PI染色检测低血清生存压力胁迫与顺铂药物毒性下过表达IL-1αpropiece对细胞周期的影响。结果:IL-1αpropiece过表达能够促进jurkat细胞与P388细胞增殖,增加G2/M期细胞百分比,并在顺铂毒性及低血清胁迫实验中降低细胞凋亡水平。结论:IL-1αpropiece过表达能够促进急性淋巴白血病细胞增殖,抑制细胞凋亡以及增加G2/M期细胞。第三部分IL-1αpropiece过表达生物芯片检测与数据挖掘目的:探寻IL-1αpropiece在急性淋巴白血病细胞中的作用机制,生物芯片检测过表达IL-1αpropiece引起的差异表达基因,并对信号通路、信号网络、分子功能的影响进行数据挖掘。方法:在过表达IL-1αpropiece急性淋巴细胞白血病细胞中使用Agilent Human4x44K gene expression array对基因表达谱的变化进行检测。聚类分析差异表达基因。选取Gene Go与GO(Gene Ontology)数据库找出与差异基因相关的通路与生物学过程。通过I-TASSER对propiece的空间结构进行预测,结合DBD-Hunter数据库,Bind N数据库,DISPLAR数据库与i DBPs server数据库的结果对propiece与DNA的结合能力进行分析。利用PRIMA算法富集了差异表达基因的共同启动子。结果:芯片信息通过聚类分析可以发现MT家族基因与NF-κB靶基因均上调。基于Gene Go数据库的分析中,通过对比110个已经注释过的信号动态网络,推测propiece可能通过从血管新生,炎症,抗凋亡,神经新生等方面对疾病进行调控。I-TASSER数据库分析出的空间结构也具有与DNA结合的可能性,并且PRIMA算法富集得到Sp1启动子为下调基因的共同启动子区域。结论:IL-1αpropiece能够对动态神经网络的进行调节,并且预测具有核酸结合的结合区域。可能通过调控Sp1启动子区域达到生物学功能。第四部分IL-1αpropiece对信号通路的调控及其核酸结合片段的筛选目的:对本课题前期通过生物信息取得的预测结果进行验证。构建Sp1 mini promoter文库寻找能与IL-1αpropiece发生相互作用的DNA序列信息。方法:使用免疫印迹对信号通路中发生改变的关键节点基因检测,对利用差异表达基因数据挖掘产生的信号网络进行验证。获得重组IL-1αpropiece蛋白,与Sp1 promoter deletion assay混合,经过SELEX方法筛选,经过四轮进化筛选。最终亲和力高的文库片段被连入T载体。测序后根据结果对每个区域计数统计,获得IL-1αpropiece的高亲和力区域。并且分析其结合DNA motifs。使用丰度更高的商品化文库与IL-1αpropiece进行SELEX实验,提高IL-1αpropiece结合DNA序列的分辨率。结果:IL-1αpropiece能激活NF-κB,AKT与p38 MAPK通路,降低外源性凋亡,上调抗凋亡基因。IL-1αpropiece能与Sp1启动子部分DNA发生相互作用。结论:IL-1αpropiece通过调控NF-κB通路,AKT通路与p38 MAPK通路协同作用发挥细胞促进增殖,抑制凋亡的功能。SELEX的方法筛选与IL-1αpropiece结合的DNA序列,DNA序列具有CG含量高的特点。