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脓毒症是由细菌感染引起的以全身性炎症反应为特征的临床重症,极易引起组织损伤及器官功能失调,可导致多器官功能衰竭甚至死亡,是重症监护室中常见综合征,死亡率一直居高不下,严重威胁患者健康。脓毒症患者广泛存在严重血管渗漏,即血管屏障功能下降,通透性增高,血液内炎症因子、补体、脂质等大分子物质可异常透过内皮屏障到达各组织器官,引起组织严重水肿,机体有效循环血容量显著下降,严重影响组织及器官功能并危及患者生命。微粒(microparticle,MP)是一种几乎所有细胞均可分泌的微小膜性囊泡,可在细胞凋亡或受到刺激时产生,直径约为0.1—1μm,内部可携带多种生物活性分子如蛋白质、DNA、RNA等。目前研究已证实,MP能够广泛参与炎症、凝血、免疫抑制等病理生理过程,可在多种疾病如动脉粥样硬化、心肌炎、子痫前期、急性肺损伤、慢性肾炎等的发生发展过程中发挥作用。已有研究表明,脓毒症后MP含量可显著增加,可以通过调节一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶、活性氧簇等信号分子影响内皮功能,调节血管舒缩反应。而MP是否能够调节脓毒症后血管渗漏以及哪种MP在其中起到主要作用目前仍不清楚。据此,本研究使用盲肠结扎穿孔术(Cecal Ligation and Puncture operation,CLP)复制大鼠脓毒症模型及LPS刺激肺静脉内皮细胞,分别从整体及离体水平研究MP对脓毒症血管渗漏的调节作用并初步探讨其机制,最后从临床脓毒症患者血液中收集MP,验证MP对脓毒症血管渗漏的作用。具体内容包括三部分:(1)MP在脓毒症后血管渗漏中的作用;(2)MP调节脓毒症后血管渗漏的机制;(3)临床脓毒症患者MP对大鼠血管渗漏的作用。主要实验方法:使用盲肠结扎穿孔术复制大鼠脓毒症模型,差速离心法收集并纯化MP,流式细胞仪及透射电镜对MP进行鉴定;异硫氰酸荧光素标记的荧光白蛋白(Fluorescein isothiocyanate-Bovine Serum Albumin,FITC-BSA)检测血管渗漏情况;提取大鼠肺静脉内皮细胞,检测跨膜电阻(Trans Electric Resistance,TER)及FITC-BSA透过率;RT-q PCR法测定MP中微小核糖核酸(micro RNA,miR)含量;蛋白免疫印迹及免疫荧光检测内皮细胞紧密连接ZO-1表达。研究内容:第一部分EMP在脓毒症后血管渗漏中的作用1、使用盲肠结扎穿孔术复制大鼠脓毒症模型,检测大鼠脓毒症后肺、肾、肠血管渗漏变化;收集脓毒症大鼠血液中MP并检测其含量。2、使用脓毒症大鼠血液中MP作用于正常大鼠,检测其对大鼠肺、肾、肠血管渗漏的作用。同时从正常大鼠中提取肺静脉内皮细胞、中性粒细胞及血小板,分别使用LPS刺激后制备内皮细胞微粒(Endothelial microparticle,EMP)、中性粒细胞微粒(Neutrophil microparticle,NMP)及血小板微粒(Platelet microparticle,PMP),检测不同来源MP对肺血管渗漏的影响。3、使用Transwell培养单层肺静脉内皮细胞,利用EMP刺激内皮细胞,检测TER及FITC-BSA透过率变化;使用免疫荧光及Western Blotting检测EMP刺激对内皮细胞紧密连接ZO-1表达的影响。第二部分EMP调节血管渗漏的机制1、分别提取脓毒症大鼠MP及经LPS刺激的EMP中miR,使用RT-q PCR检测血管渗漏miR表达变化。2、使用LPS刺激经miR-23b干扰过的肺静脉内皮细胞,收集miR-23b(-)EMP并刺激内皮细胞,检测TER、FITC-BSA透过率变化及紧密连接ZO-1表达变化。第三部分脓毒症患者MP对大鼠血管渗漏的作用1、收集临床10名脓毒症患者及10名健康成人血液中MP,对比其含量差异。2、收集临床脓毒症患者血液中MP,作用于正常大鼠及内皮细胞,分别检测肺血管渗漏及TER、FITC-BSA、ZO-1表达变化。主要研究结果:第一部分EMP在脓毒症后血管渗漏中的作用1、大鼠脓毒症后肺、肾、肠血管血管渗漏程度及MP含量显著增加,且不同时相点两者增加程度基本一致。2、脓毒症大鼠MP可明显增加正常大鼠肺、肾、肠血管渗漏。经LPS刺激的EMP可明显增加正常大鼠肺血管渗漏,而LPS刺激的NMP及PMP对大鼠肺血管渗漏无明显作用。3、LPS刺激的EMP可以明显降低内皮细胞单层跨膜电阻值,增加FITC-BSA的透过率,显著降低肺静脉内皮细胞ZO-1表达。第二部分EMP调节脓毒症后血管渗漏的机制1、脓毒症后MP中miR-23b、miR-29a、miR-125a、miR-126a、miR-181a、miR-199a、miR-203、miR374含量增加较为显著,经LPS刺激的EMP内miR-23b增加最为显著。2、抑制EMP内miR-23b表达后,可显著降低EMP引起的内皮细胞通透性增高,表现为跨膜电阻值、FITC-BSA透过率及ZO-1表达与正常组相比均无明显差异。第三部分脓毒症患者MP对大鼠血管渗漏的作用1、脓毒症患者MP含量明显高于健康成人。2、脓毒症患者MP可显著增加大鼠肺血管渗漏,且增加内皮细胞通透性。结论:1、脓毒症后血液中MP含量显著增加,并可显著增加大鼠血管渗漏,EMP在其中发挥主要调节作用。2、脓毒症后EMP内miR-23b改变最为显著,miR-23b在EMP调节血管渗漏中起到重要作用。3、临床脓毒症患者研究证实了前期动物实验结果,即脓毒症患者MP含量显著增加,脓毒症患者MP可显著增加大鼠血管渗漏。