慢性牙髓炎是指发生于牙髓组织的慢性炎症性病变,主要表现为剧烈的疼痛,严重影响患者的身心健康和生活质量。儿童除具有以上影响外,还可能因疼痛而导致偏侧咀嚼,进而影响颌骨发育及颜面部形态。当牙髓发生炎症或损伤时,延髓背角在细胞形态、基因表达及突触连接等方面发生变化,从而参与炎症疼痛下延髓水平的中枢敏化过程,形成牙髓炎特征性的刺激痛等症状。现在越来越多的实验表明:mi RNA是一种新层次上的基因表达调控方式,参与背根神经节、脊髓背角等处疼痛状态下疼痛相关基因表达的改变。但迄今为止的,mi RNA是否参与牙髓炎疼痛的中枢调控尚属新的领域,国内外未见报道。课题组前期研究发现:开髓暴露法可产生理想的慢性牙髓炎痛敏模型;基因芯片检测发现,与对照组相比,慢性牙髓炎术后1天大鼠延髓背角多种mi RNA分子变化显著,其中mi R-34a表达显著降低;而文献报道mi R-34a可调控多种疼痛相关基因的表达与活性。这为我们研究慢性牙髓炎疼痛的中枢调控机制提供了新思路:mi R-34a可否作为一种基因表达调控方式,参与慢性牙髓炎疼痛状态下,延髓背角内疼痛相关基因表达的改变。基于以上假设,我们设计如下实验,旨在探索慢性牙髓炎疼痛的中枢调控机制,从而为研发牙髓炎镇痛药物提供新的靶点和思路。【目的】本课题拟从mi RNA分子参与慢性牙髓炎疼痛中枢调控入手,筛选出mi R-34a及其下游靶基因SIRT1;通过检测牙髓炎模型术后不同时间点延髓背角mi R-34a、SIRT1的表达变化及细胞定位分析,探讨mi R-34a、SIRT1与慢性牙髓炎疼痛之间的关系;通过慢病毒感染过表达mi R-34a、鞘内给予白藜芦醇过表达SIRT1分子,探讨mi R-34a分子是否通过抑制下游靶基因SIRT1的表达水平,进而参与慢性牙髓炎疼痛的中枢调控机制。【方法】1.建立慢性牙髓炎痛敏模型:健康成年雄性SD大鼠,随机分为牙髓炎组和对照组;牙髓炎组麻醉后于左侧上颌第一磨牙,用1/2球钻开髓并使之暴露于口腔,对照组麻醉后不作处理。于术前1 d、术后1、3、7、14 d检测擦面行为总时间,评估大鼠疼痛反应;不同时间点取延髓和牙髓,制作延髓冰冻切片及牙髓石蜡切片,用免疫荧光染色方法检测延髓中c-Fos蛋白及牙髓中TNF-α的表达情况,HE染色观察牙髓的炎症情况。2.基因芯片筛选出牙髓炎术后1d组与对照组之间的差异mi R-34a分子;实时定量PCR进一步验证;原位杂交和免疫荧光双标技术定位mi R-34a表达的细胞类型;通过软件分析及文献回顾,预测mi R-34a可能作用的靶基因;实时定量PCR和免疫荧光技术对靶基因进一步验证;免疫荧光双标技术定位SIRT1表达的细胞类型。3.外科手术暴露大鼠延髓背角,体内感染mi R-34a慢病毒过表达载体,感染3w后建立慢性牙髓炎痛敏模型,术后1d检测大鼠疼痛行为及同侧延髓背角mi R-34a、SIRT1的表达水平;小脑延髓池白藜芦醇鞘内置管连续给药过表达SIRT1,牙髓炎术后1d检测实验大鼠痛行为变化。【结果】1.痛行为学结果显示:牙髓炎疼痛具有时间相关性,术后1d疼痛达到峰值,随后疼痛程度逐渐降低;HE染色结果表明:牙髓炎术后1、3、7、14d,牙髓炎症和坏死组织边缘分别位于髓角、根颈1/3、根中1/3和根尖1/3处;牙髓TNF-α免疫荧光染色主要表达于邻近坏死层的炎性牙髓组织内,急性期(术后1d)表达最高;c-Fos免疫荧光染色结果显示,术后2h延髓背角c-Fos阳性细胞显著增多,提示延髓背角细胞活化。2.基因芯片检测发现,大鼠延髓背角多种mi RNA分子变化显著,其中mi R-34a表达降低;q PCR结果表明,与对照组相比,牙髓炎术后mi R-34a表达显著下调,除术后14d外,差异均有统计学意义(P<0.05)。荧光原位杂交及免疫荧光双标结果显示:延髓背角有大量mi R-34a杂交信号并与神经元标记物Neu N共存,提示mi R-34a主要表达于神经元;与对照组相比,实验组大鼠同侧延髓背角mi R-34a显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。通过软件预测及文献回顾分析,我们选取Bcl-2、SIRT1、P53、HGF、Notch-1、USF-1和Met为可疑靶基因,通过q PCR进一步筛选出SIRT1为mi R-34a在慢性牙髓炎疼痛调控中的下游靶基因。q PCR及免疫荧光进一步验证显示:牙髓炎术后SIRT1表达显著上调,牙髓炎术后3d,SIRT1表达最高,随后表达逐渐降低,与对照组相比差异明显,有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光双标结果显示:延髓背角内SIRT1与神经元标记物NSE共存,与细胞核标记物DAPI少量共存,提示SIRT1分子主要表达在神经元胞质内。3.体内慢病毒感染过表达mi R-34a后:慢性牙髓炎术后1d,大鼠疼痛程度明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,mi R-34a显著增加3.25倍,SIRT1降低0.45倍,差异有统计学意义(P<0.05)。小脑延髓池连续给予SIRT1激动剂白藜芦醇后:SIRT1显著增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);慢性牙髓炎术后1d疼痛程度降低,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】1.牙髓暴露法操作简单,能有效的模拟临床牙髓炎及其痛敏过程,可构建理想的实验性牙髓炎痛敏模型;2.在延髓背角,mi R-34a和SIRT1主要表达于神经元;慢性牙髓炎状态下,mi R-34a显著降低、SIRT1显著增加,且具有时间相关性,提示mi R-34a、SIRT1分子与慢性牙髓炎疼痛关系密切;3.SIRT1具有神经保护作用,过表达SIRT1能发挥明显的牙髓炎镇痛作用;4.mi R-34a通过抑制靶基因SIRT1表达,参与慢性牙髓炎疼痛的中枢调控。