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利用细胞融合技术成功制备的杂交瘤单克隆抗体(mAb)在疾病的预防和诊治等方面显示出了重要作用,但因为鼠源性抗体在人体应用时容易诱发HAMA,产生不良反应。抗体库技术为制备高亲和性的人源抗体提供了有力工具。该技术无需免疫即可制备全人源性抗体,可有效避HAMA。我实验室利用噬菌体抗体库技术,构建了全人源肝癌单链抗体噬菌体库,并筛选到了一株肝癌特异性单链抗体。目的构建单链抗体的原核表达系统,实现蛋白的高效表达,并鉴定其与肝癌组织结合的特异性及亲和力,为其下一步应用研究打下基础。方法1全人源肝癌单链抗体载体构建和原核非融合表达及复性,与肝癌细胞特异性结合鉴定。以肝癌单链抗体噬菌体载体pDAN5/ScFv-D25为模板,利用重叠延伸PCR,将VL和VH基因以(Gly4ser)3 linker连接成单链,将PCR产物连接入T载体并测序,将目的片段酶切插入表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测表达情况。对包涵体进行溶解、变性、复性、纯化,得到可溶性目的蛋白,应用细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及亲合能力。2全人源肝癌单链抗体(D25)在大肠杆菌中的分泌表达及与人体肝癌组织特异性结合鉴定;酶切pGEM/D5载体,酶切片段插入表达载体pET32a+的酶切位点中,转化E. coli BL21trxB,蛋白表达, SDS-PAGE电泳检测表达情况。应用细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及结合能力。利用63例肝癌组织芯片、5例正常肝组织及3例胰腺癌组织,免疫组化方法检测D25与人体肝癌组织特异性结合情况。结果1构建了D25原核表达载体,经IPTG诱导,成功获得了表达,表达蛋白相对分子质量32KD左右。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的26%,包涵体经过复性纯化后,细胞ELISA鉴定能与SMMC-7721细胞特异性结合,亲和常数为:3.6×107 L/mol。2构建了pET32/d25单链抗体载体,转化E. coli BL21trxB诱导表达后,成功获得目的蛋白与TrxB蛋白融合可溶性表达,表达产物主要存在于周质腔中。SDS-PAGE电泳检测结果表明:融合蛋白分子量为42KD左右。ELISA检测,表达产物与SMMC-7721细胞有很好的结合活性,利用组织芯片行免疫组化结果显示其与5例正常肝组织及3例胰腺癌组织无结合,而与人肝癌细胞结合阳性反应率68.3%(43/63),与前两组比较差异显著。结论通过噬菌体抗体库筛选得到的肝癌特异性单链抗体可以通过原核表达系统,实现蛋白的高效表达;肝癌特异性单链抗体能与肝癌SMCC-7721细胞系及人肝癌组织特异性结合,并且有较强的亲和力,为今后进行免疫学检测和开发肿瘤靶向治疗提供了研究手段。在亚洲、非洲地区,在患恶性肿瘤病人中,肝细胞肝癌(HCC)是导致患者死亡的主要原因,尽管目前对肝癌可以采取手术切除、动脉插管化疗、放疗及局部治疗等方法,但效果欠佳,人们一直在寻找一种有效治疗肝癌的途径,抑制肝癌血管生成是治疗肿瘤的新策略。目的肿瘤新生血管形成在肿瘤发生发展过程中起着重要作用。本实验主要探讨COX-2在肝癌及其诱导血管形成过程中的作用机制及途径。方法1.构建COX-2小干扰RNA(siRNA)表达质粒,设计有小发夹结构的2条COX-2 siRNA对应模板DNA序列,煺火处理后克隆至pSIREN-Shuttle质粒,构建重组质粒pSIREN/COX-2 siRNA,同样方法构建阴性对照质粒pSIREN/negative siRNA。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,酶切鉴定,再将pSIREN/COX-2 siRNA和pSIREN/negative siRNA转染HuH-7细胞系,构建稳定转染细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot检测COX-2表达。采用PGE2试剂盒检查细胞培养液PGE2的变化情况。2.利用基因芯片技术观察COX-2特异性抑制剂SC-58635应用后HuH-7细胞系所表达的与血管形成相关的22条基因的变化情况。根据基因芯片法抽提细胞mRNA,进行反转录cDNA探针,与GEArray Q Series Human CancerPathway Finder Gene Array芯片进行杂交,并对结果进行分析。3.分别利用选择性COX-2抑制剂(SC-58635)和COX-2siRNA抑制HuH-7细胞系COX-2的表达,收集抑制前后HuH-7细胞培养液,研究以上培养液在体外对人脐静脉血管内皮细胞增殖能力、迁移能力及细胞小管形成能力的影响,以及在体内对血管生成的影响。结果1.酶切电泳证实,重组质粒pSIREN/COX-2 siRNA和pSIREN/negative siRNA载体构建成功,转染HuH-7细胞后,COX-2siRNA可以显著抑制HuH-7细胞的COX-2 mRNA及蛋白的表达,而对COX-1表达无影响。COX-2 siRNA抑制COX-2表达后可以使PGE2的合成量下降约72%。2.我们通过基因芯片技术观察了HuH-7在应用特异性COX-2抑制剂SC-58635后, 22条血管生成相关基因表达的变化情况,结果显示,血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、原纤维细胞生长因子2(FGF2)、血管生成素1(ANGPT1)及血管生成素2(ANGPT2)等促血管生成因子在COX-2抑制后表达下降超过2倍,VEGF下降达到4.5倍。3.选择性COX-2抑制剂SC-58635和COX-2siRNA抑制HuH-7细胞系COX-2的表达后,HuH-7细胞培养液明显抑制了HUVEC的增殖能力、迁移能力及细胞小管形成能力,在体内的血管生成也同样受到抑制。并且在细胞培养液中加入外源性PGE2后可以部分逆转这种对血管生成的抑制作用。结论体内及体外的血管形成实验均证实,COX-2抑制剂及COX-2 siRNA均可以通过抑制COX-2的表达从而抑制肝癌诱导的肿瘤血管形成。在HuH-7诱导血管形成过程中,COX-2促进PGE2合成,PGE2直接作用于血管内皮细胞促进血管形成。除了COX-2通过促进PGE2合成直接促进血管形成途径外,COX-2还可以通过促进PGE2的释放,刺激血管内皮生长因子等血管形成因子合成增加,促进血管形成。本实验说明:COX-2是肝癌诱导血管形成过程中的关键因素,COX-2使通过诱导PGE2合成,PGE2通过直接刺激血管形成以及促进血管形成相关因子的表达间接促进血管形成两种途径起作用。提示COX-2抑制剂在治疗肝癌反面是一个很有前途的化学药物。