溶藻弧菌HY9901的TRAP转运体底物结合蛋白DctP功能研究

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近年来,由溶藻弧菌引起的弧菌病严重影响了海水养殖业的发展。传统的抗生素虽然能够有效的防治弧菌病,但也导致了耐药菌和药物残留等环境问题的出现。因此,迫切需要有效、健康、可持续且对环境友好的疫苗接种来防控弧菌病。在本研究中,我们通过构建溶藻弧菌TRAP转运体底物结合分子dctP基因的缺失株,分析缺失株ΔdctP生物学功能特性;进一步应用转录组技术分析缺失株ΔdctP和野生株HY9901基因表达情况;最后,我们应用缺失株ΔdctP作为候选减毒活疫苗评价其安全性和对石斑鱼的免疫保护率。结果表明dctP基因可能具有直接或间接调控溶藻弧菌黏附、定植和致病的功能,且缺失株ΔdctP作为减毒活疫苗能够显著提高珍珠龙胆石斑鱼的免疫保护效果。研究结果为深入探讨溶藻弧菌dctP功能奠定理论基础。研究结果如下:(1)溶藻弧菌缺失株ΔdctP的构建及生物学特性研究。首先,使用PCR扩增技术对dctP基因进行扩增,确定该基因全长999 bp。接着,利用同源重组技术,结合正、反向筛选方法,成功构建ΔdctP缺失株和回补株C-dctP,并以回补株作为对照组,进行生物学特性探究。结果显示,与野生株HY9901相比,缺失株ΔdctP在形态特征和生长曲线无显著差异,而泳动能力、生物膜形成能力、ECPase形成能力、细胞粘附力和定植能力显著降低。此外缺失株ΔdctP的LD50较野生株HY9901显著提高40倍,说明该缺失株致病力显著降低。(2)对溶藻弧菌野生株HY9901与缺失株?dctP进行转录组测序分析。使用转录组测序共筛选出423个差异表达基因,其中204个上调基因,219个下调基因。KEGG分析发现野生株HY9901与缺失株?dctP之间的差异表达基因主要分布在双组分系统、鞭毛组装和ABC转运体3大通路中。此外,我们在DEG文库中筛选出22个与定植、粘附和致病相关的基因,结合缺失株ΔdctP生物学特性,从分子水平证明dctP基因可能具有直接或间接调控溶藻弧菌黏附、定植和致病的功能。(3)缺失株?dctP作为减毒活疫苗对石斑鱼免疫保护效果。本研究以珍珠龙胆石斑鱼为研究对象,评价了缺失株ΔdctP减毒活疫苗对珍珠龙胆石斑鱼的安全性、免疫保护及特异性和非特异性免疫应答效果。结果表明:缺失株ΔdctP对珍珠龙胆石斑鱼的安全剂量为≤1.0×10~6 CFU。缺失株ΔdctP腹腔注射攻毒石斑鱼后的相对存活率为74.4%。免疫相关基因Ig M、IL-1β、IL-8、IL-10、MHC-Iα、MHC2、TNF-α、TLR3、CD4在接种后28 d内表达上调。免疫后石斑鱼血清特异性抗体Ig M、血清总蛋白、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶活性均显著高于对照组。综上,缺失株ΔdctP可作为防治珍珠龙胆石斑鱼感染溶藻弧菌的减毒活疫苗候选疫苗。
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