RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来新发现的一项基因沉默技术,是指双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)特异性抑制体内同源基因表达的过程。2002年RNAi被《Science》评为十大科技突破之首。目前RNAi主要应用于基础研究,如功能基因组研究、信号转导等。在病毒学领域中,RNAi研究也取得了一定成果,包括HIV、HBV、HCV、呼吸道荷包病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、严重急性呼吸综合症病毒等。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原体之一。慢性HBV感染导致的肝炎后肝硬化和肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)等终末期肝病,已成为严重危害我国人民生命健康的主要疾病。近些年来虽然新型抗HBV药物不断面世,但是疗效仍然不尽如人意,仍需探索新型的抗HBV的药物和方法。因此,深入了解RNAi抑制HBV复制和抗原表达以及其相关性HCC生长能力的变化具有重要意义。HBV基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA分子,HBV基因组在C’端高度重叠,是RNAi的理想目标,具有四个开放阅读框,编码四种蛋白,其中LHBs和HBx蛋白是具有潜在致癌作用的蛋白,在肝细胞癌变过程发挥重要作用,针对HBx蛋白已有大量研究,也有少量研究提示HBS在肝细胞癌变过程发挥重要作用,但是其发挥作用的确切的分子生物学机制和具体细胞内信号转导途径还不清楚。为了进一步了解其中机制,我们利用基于miRNA骨架的的慢病毒载体介导的RNAi技术抑制HBS的表达,观察其对HBV复制和抗原表达以及HCC细胞生长能力的作用,通过HepG2.2.15细胞裸鼠皮下成瘤后多点注射RNAi慢病毒观察其对肿瘤生长的作用,进一步利用基因芯片技术了解相关信号转导通路蛋白表达变化。迄今为止,还没有研究利用miRNA骨架携带的siRNA抑制HBS蛋白表达的报道,尤其是由CMV启动子启动、慢病毒载体介导基于miRNA的RNAi技术。实验中首先设计并合成针对HBS基因区的3条siRNA,利用pSUPER-RNAi载体系统进行靶位点的初步筛选,同时设计针对与HBS无关的序列作为随机对照,所选靶点在HBV各基因型中高度保守,尤其是对在我国流行的B和C型HBV中也高度保守。利用pSuper载体携带siRNA,和HBV质粒同时瞬转人胚肾293T细胞,72小时后用Real-Time PCR和ELISA鉴定三个靶位点对的干扰效果。结果显示其中一个靶位点在蛋白水平抑制效果明显,可达70%以上,并且可降低mRNA水平的表达水平50%以上,另外两个靶位点没有明显作用。鉴于质粒载体转染肝癌细胞系效率低下,我们又把这个特异性siRNA对应的DNA双链序列克隆入慢病毒载体内,包装成慢病毒后转染肝癌细胞系作进一步的研究。两条核苷酸单链退火后形成双链DNA,然后连接入PGCLM-001质粒的EcoRⅠ/XbaⅠ位点。所得慢病毒载体同包装质粒共转染293T细胞产生慢病毒,48小时后收集细胞上清,经过0.45μm膜过滤,得到病毒原液,经过超速离心,可以得到浓缩后的病毒。至此携带HBS RNAi靶点基于miRNA骨架的慢病毒已经制备完毕,稀释后以不同感染复数(MOI)值感染HepG2.2.15细胞。利用ELISA方法分析细胞分泌到上清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞内蛋白,利用western blot方法分析细胞内HBsAg含量,提取细胞内RNA,RT-PCR得到cDNA,realtime PCR方法分析HBS在mRNA水平变化,利用荧光定量PCR方法对上清中HBV DNA定量进行检测,通过以上方法明确所构建慢病毒对HBS的RNAi作用;利用3×107 HepG2.2.15细胞于3-4周大小雄性裸鼠两侧背部皮下注射,构建HepG2.2.15细胞皮下成瘤动物模型,多点注射慢病毒后每隔5-10天观察HBS RNAi后肿瘤的生长速度变化;通过基因芯片筛选相关信号转导通路基因。实验结果证实慢病毒HBS RNAi后,对HBV复制和抗原表达的抑制作用显著。感染4天后,抑制效应开始出现,一直持续到第9天,抑制效应达到高峰。相对于阴性对照细胞上清中HBsAg分泌量可以下降70%以上,而western blot和realtime PCR结果进一步证实了上述结果,在蛋白水平和mRNA水平都得到了进一步验证。上述HBS RNAi慢病毒对HBV DNA复制表现出显著的抑制作用,检测发现感染后第5天HBV DNA水平抑制率为80%以上,可以明确慢病毒介导的,基于miRNA发挥作用的RNAi技术能够在HepG2.2.15细胞系中抑制HBV的复制和抗原表达,裸鼠成瘤模型HBS RNAi后,肿瘤生长速率较阴性对照组下降明显;通过基因芯片筛选出了相关的肿瘤信号转导通路基因,包括与细胞周期控制相关基因:SEPT6、E2F3;与细胞生长分化相关基因:FOS、PIM1;其他肿瘤相关基因:ACP2、BHLHB2、CLK3、CTSC、NR1D1。通过上述实验证明慢病毒HBS RNAi可以成功的抑制病毒复制和抗原表达,这一技术依据人体生理模式发挥作用,潜在的副作用小,为HBV和HCC患者的治疗带来新的希望。HBS在肝细胞癌变过程发挥中重要作用,HBV感染后不仅仅是激起机体的免疫反应,引起慢性坏死炎症性肝脏疾病,还触发了一些特异性的癌变信号转导通路,促进或引起细胞癌变。相信随着该领域研究的不断深入,应用慢病毒RNAi技术抗HBV的实验也必将从实验研究走向临床应用,基于miRNA系统的慢病毒RNAi技术将为发展特异性的抗HBV基因治疗提供新的技术平台。