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研究背景：银屑病是一种常见的有遗传背景并受环境、感染等多种因素影响的慢性复发性疾病。多数学者认为它是Thl-Th17轴占主导地位的自身免疫性系统性炎症性疾病,可合并心血管疾病、糖尿病、代谢综合征、抑郁及炎症性肠病等。近年来有关银屑病免疫发病机制的研究较多,其中免疫细胞、遗传调控、相关炎症分子之间的相互作用越来越受到重视,而信号传导途径的异常可能在其中起到关键作用。研究目的：从信号通路传导角度探讨清热活血解毒法(复方及中药单体)干预HaCat细胞的机制,研究清热活血解毒法治疗寻常型银屑病的作用机制,明确其作用靶点。研究方法：应用TNF-α活化HaCat细胞24小时,再添加PI3K/Akt信号通路的特异性阻滞剂LY294002干预1小时,制备实验所需的细胞模型。观察清热活血解毒复方及中药单体落新妇苷对经TNF-α活化的HaCat细胞的生物学行为影响,及PI3K/Akt信号通路对其的调控作用。包括采用CCK-8法检测清热活血解毒复方及落新妇苷干预经TNF-α活化的HaCat细胞的增殖情况；应用蛋白质印迹法(、Vestern blotting)及RT-PCR检测信号通路蛋白Akt及CREB的表达,以及凋亡基因bax、bcl-xl及c-fos的表达；采用流式细胞术(flow cytometry, FCM)分析细胞各周期分布情况及细胞凋亡率；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的分泌。研究结果：(1)清热活血解毒复方能够抑制PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白及基因的表达,并且在Akt蛋白的抑制中呈现剂量依赖；信号通路被阻滞后,抑制作用虽仍然存在,但与通路阻断前相比,差异已无统计学意义。同时,清热活血解毒复方对CREB蛋白及基因的表达均有明显抑制作用,且随着剂量的增加而增强,尤其是在应用高剂量(30mg/ml)时：信号通路被阻滞后,复方对CREB的抑制作用较阻断前有所减弱。清热活血解毒复方对经TNF-α活化的HaCat细胞具有良好的抑制增殖作用；在信号通路被阻断后,细胞的增殖继续受到抑制。清热活血解毒复方对TNF-α舌化的HaCat细胞凋亡的影响主要表现在促进其早期凋亡；通路被阻断后,复方可使HaCat细胞的早期凋亡率继续上升,晚期凋亡率下降。清热活血解毒复方可使HaCat细胞大量阻滞于S期而无法进入有丝分裂期,从而发挥其抑制HaCat细胞增殖的作用；在通路被阻断后,复方使HaCat细胞G0/G1期所占比重增加,S期下降。清热活血解毒复方可上调bax的表达,并且该上调作用与复方剂量呈现依赖性；在通路被阻断后,复方对bax的上调能力受到影响,这种影响在高剂量组中表现的尤为突出。清热活血解毒复方可降低TNF-α舌化的HaCat细胞中bcl-xl的表达；在通路被阻断后,复方的下调作用较之阻断前有所加强。清热活血解毒复方可降低TNF-α活化的HaCat细胞中c-fos的表达,而且下调作用与复方剂量相关：在通路被阻断后,复方对于c-fos蛋白的表达在阻滞前后无明显变化。清热活血解毒复方能够抑制HaCat细胞中IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的分泌。PI3K/Akt信号通路在这些炎症因子的分泌中均起到调节作用,同时在复方抑制HaCat细胞分泌IFN-γ、IL-1 β及IL-6的作用存在密切的联系,而在IL-8的分泌上则未表现出明显的相关性。(2)落新妇苷可以抑制经TNF-α活化的HaCat细胞中Akt的表达,抑制作用随剂量的增加而增强,并在Akt蛋白的抑制上呈现剂量依赖；在阻滞通路后,落新妇苷对Akt的表达较阻滞前有所减弱。落新妇苷对CREB则有较好的抑制作用,在CREB蛋白的抑制上呈现剂量依赖；在阻断通路后,落新妇苷对CREB的抑制作用较阻断前相比继续增强。落新妇苷能够抑制经TNF-α活化的HaCat细胞的增殖,且抑制作用随着剂量的增加而增强；在阻断PI3K/Akt通路后,落新妇苷的抑制增殖作用较前减弱,但随着时间的推移,落新妇苷的抑制增殖作用比未阻断通路时增强。落新妇苷可使经TNF-α活化的HaCat细胞S期的细胞数量增多,G0/G1期及G2/M期的细胞数量同时减少；在通路被阻滞后,落新妇苷使HaCat细胞G0/G1期与G2/M期的细胞数量持续减少,S期细胞数量持续增加。落新妇苷在经T NF-α活化的HaCat细胞中对bax具有上调作用,该作用随剂量的增加而增强；在通路被阻断后,上调作用较阻断前有所增强。而对bcl-xl的表达,落新妇苷则有抑制作用,同样在阻断通路后,该抑制作用有所加强。落新妇苷对原癌基因c-fos的表达有明显的抑制作用；在通路被阻断后,落新妇苷对c-fos的干预作用较阻断前有所减弱。落新妇苷可以抑制HaCat细胞分泌IFN-γ、IL-1β、1L-6及IL-8的水平,并且对于前三种细胞因子的抑制作用随着剂量的增加而增强,表现出一定的剂量依赖性。PI3K/Akt言号通路在除落新妇苷对IL-1β的干预有较为密切的关系以外,对其他细胞因子IFN-γ、IL-6及IL-8的干预均未表现出明显的相关性。结论：PI3K/Akt信号通路在HaCat绌胞的增殖、凋亡及细胞因子分泌等方面均起到重要作用。清热活血解毒复方干预HaCa t细胞的作用与调控PI3K/Akt信号通路密切相关。落新妇苷可抑制经TNF-α活化的HaCat细胞的增殖；落新妇苷干预HaCat细胞的生物学行为并非主要通过PI3K/Akt信号通路,更有可能是通过调控CREB而实现的。