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目的:有效的癌症治疗方式需要准确地定位于肿瘤组织并对机体具有最小的毒性。本实验中借助沙门杆菌对肿瘤组织的靶向性,在空间和时间上调控细胞毒性蛋白ATF6的表达,并探讨其对小鼠结肠癌的促凋亡作用机制。方法:(1)利用λRed重组技术构建减毒株S.typhimurium LT2(IRΔptsI/crr)。(2)通过小鼠体内实验鉴定减毒沙门杆菌的低毒性。(3)细菌生存实验检测减毒株IR ΔptsI/crr对小鼠结肠癌CT26细胞的入侵和复制能力。(4)Real-time PCR法检测沙门杆菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)相关基因hilA、invF、ssaG、ssaB、sseA、ssrA的表达水平。(5)CCK-8法检测CT26细胞的增殖活性。(6)利用MUSE细胞分析仪检测ATF6-p50诱导小鼠CT26细胞的凋亡作用和Bcl-2的表达情况。(7)Real-time PCR法检测小鼠CT26细胞中内质网应激(ER stress)相关基因Atf6-p50、Atf4、Chop的表达水平。(8)γ射线诱导蛋白表达后,Western blot检测ATF6-p50在减毒株IR ΔptsI/crr和CT26细胞中ER stress相关蛋白GRP78、CHOP、90ATF6、50ATF6的表达水平。(9)通过荷瘤小鼠模型探究减毒菌IR ΔptsI/crr的生物分布和ATF-p50蛋白的抗肿瘤作用。结果:(1)λRed同源重组技术:λRed重组技术敲除ptsI和crr基因,构建S.typhimurium LT2(IRΔptsI/crr)减毒菌株。(2)减毒株IR ΔptsI/crr的有效性和靶向性:6周大的BALB/c小鼠感染1×106野生型(WT)菌株后3天内全部死亡,感染减毒株IR ΔptsI/crr的小鼠在实验期间存活,差异具有统计学意义(P<0.01)。通过构建荷瘤小鼠观察减毒株IR ΔptsI/crr的靶向性。感染细菌1天后,在肿瘤中检测到大量IR ΔptsI/crr细菌。随后细菌数逐渐增加,第5天达到峰值。正常组织器官内细菌数逐渐减少,血液中的细菌在3天内被全部清除。(3)细菌生存实验:IR ΔptsI/crr减毒株感染小鼠结肠癌CT26肿瘤细胞2h后,各减毒株侵入细胞的数量与WT相比明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),说明减毒株入侵癌细胞的能力下降。18h后,IR ΔptsI/crr菌株的复制能力高于ΔptsI/crr和ΔppGpp菌株(P<0.05)。(4)Real-time PCR检测:RT-PCR法检测减毒株IR ΔptsI/crr中Ⅲ型分泌系统的毒力岛1(SPI-1)和毒力岛2(SPI-2)的相关基因表达水平。IR ΔptsI/crr的SPI-1中hilA、invF基因的表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。毒力岛2中ssaG、ssaB、sseA、ssrA表达水平与WT相比没有明显变化(P>0.05)。说明减毒株IR ΔptsI/crr的入侵能力降低,但仍具有较高的复制能力,预示减毒株IR ΔptsI/crr 比 ΔppGpp在肿瘤组织中的可操作性强。(5)CCK-8检测法:CT26细胞转染Atf6-p50后,细胞增殖能力随着时间延长明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。说明ATF6-p50对CT26细胞有抗增殖作用,并呈时间依赖性。(6)Annexin V染色法:转染Atf6-p50的CT26细胞48h后的凋亡率是48.55%,pcDNA空载质粒和空白对照组的凋亡率是分别是22.93%和13.44%,差异具有统计学意义(P<0.01)。(7)活化Bcl-2双重检测法:CT26细胞转染Atf6-p50 48h之后,与空白对照组相比,实验组中活化的Bcl-2表达量下降至49.8%,差异具有统计学意义(P<0.01)。(8)Real-time PCR检测ER stress相关基因表达:CT26细胞转染Atf6-p50 48h后,Atf6-p50和下游基因Chop表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。Atf4基因的表达无显著差异。(9)Western blot 检测:Western blot 检测减毒株 IR ΔptsI/crr和CT26 细胞中 ATF6-p50 及 ER stress蛋白的表达情况。γ射线诱导表达后,ATF6-p50能够有效表达并随辐射剂量增加而上升。感染IRΔptsI/crr*ATF6的各组CT26细胞中ATF6-p50蛋白均能表达,并随着作用时间延长,ER stress相关蛋白90ATF6、50ATF6、GRP78和CHOP表达量逐渐上升,说明ATF6-p50蛋白的过表达引起了 ER stress反应。(10)荷瘤小鼠对细菌治疗的应答:在非放射线诱导组,IRΔptsI/crr*ATF6治疗组表现了轻微的抗肿瘤作用,数据差异具有统计学意义(P<0.001)。而射线诱导ATF6-p50过表达后,肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.01)。结论:(1)减毒株IR ΔptsI/crr的毒性降低,安全性提高,对结肠癌组织具有靶向性,可以用作抗癌治疗载体。(2)ATF6-p50的过表达通过内质网应激途径诱导小鼠结肠癌CT26细胞凋亡。(3)γ射线治疗可能通过辐射旁效应影响肿瘤微环境,与减毒株IRΔptsI/crr联合治疗对肿瘤发挥超叠加的抑制效应。