普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是一种淀粉脱支酶,能专一性水解普鲁兰多糖、支链淀粉以及相关糊精的?-1,6-糖苷键。它主要应用于淀粉糖加工工业中,具有提高原料利用率、减少副产物生成、缩短反应时间等作用。此外,普鲁兰酶还被广泛应用于医药、酿造、饲料等行业中。然而,由于存在发酵单位较低、生产成本较高等问题,目前国内普鲁兰酶的工业化生产规模较小,无法满足市场需求,长期依赖于进口。本研究室在前期研究中,实现了Bacillus deramificans普鲁兰酶在大肠杆菌中的表达,并通过定点突变、结构域切除等方式对其进行改造,获得了耐酸耐热且具有较高应用价值的普鲁兰酶。然而,该酶在大肠杆菌中表达存在容易形成包涵体、胞外分泌较差等问题,很难满足工业生产的需求。本论文针对前期研究中存在的问题,运用多种策略促进普鲁兰酶在大肠杆菌中的可溶性分泌表达;选择了具有高效分泌蛋白能力的短小芽孢杆菌表达普鲁兰酶,通过发酵优化提高其表达量,并探讨了镁离子促进短小芽孢杆菌表达“高活性”普鲁兰酶的作用机制。此外,还研究了普鲁兰酶在麦芽糖基-?-环糊精制备中的应用。主要研究结果如下:(1)研究了表面活性剂减少普鲁兰酶聚集体的形成和促进重组蛋白胞外分泌的作用。研究表明,Bacillus deramificans普鲁兰酶容易形成活性聚集体,而表面活性剂对普鲁兰酶聚集体具有解聚作用,可将其转变成可溶性蛋白。在摇瓶中依次考察了表面活性剂的种类、浓度和添加时间对大肠杆菌生长和产酶的影响。结果表明,在发酵中添加Triton X-100,不仅能够有效促进普鲁兰酶的可溶性表达,而且还能提高重组蛋白的分泌效率。以摇瓶实验为基础,进行了大肠杆菌3-L罐高密度发酵。通过添加Triton X-100,普鲁兰酶的胞外活力和分泌效率提高至812.4 U/m L和86.4%,相比对照分别提高了46.2和45.5倍。(2)通过协调蛋白合成与分泌速度,实现了普鲁兰酶在大肠杆菌中的高效可溶性分泌表达。在摇瓶上考察了诱导剂种类和浓度、甘氨酸浓度对大肠杆菌生长和产酶的影响。结果表明,较低的诱导强度更利于普鲁兰酶的可溶性表达,甘氨酸能够有效促进普鲁兰酶的胞外分泌。以摇瓶实验结果为基础,在3-L罐上优化了乳糖流加速度。当以0.4g/L/h的速度流加乳糖时,普鲁兰酶可溶性总酶活达2731.1 U/m L,但胞外分泌效率仅为3.2%。考察了诱导时间对大肠杆菌生长和产酶的影响。结果表明,早期诱导和在菌体生长中提供充足的甘氨酸可能是促进重组蛋白分泌的关键因素。因此,通过在细胞干重(DCW)为15 g/L时诱导结合甘氨酸流加策略强化重组蛋白的胞外分泌,普鲁兰酶胞外活力和分泌效率可达1567.9 U/m L和62.1%,相比优化前分别提高了21.5和9.5倍。该结果代表了普鲁兰酶目前资料报导的最高发酵水平。(3)研究了普鲁兰酶在短小芽孢杆菌中的重组表达和酶学性质,并通过摇瓶优化提高表达量。构建了带有Bacillus deramificans普鲁兰酶基因pul A-d2的重组菌Brevibacillus choshinensis(p NCMO2/pul A-d2)。重组短小芽孢杆菌在发酵过程中将绝大部分的普鲁兰酶分泌到胞外,胞内可溶重组蛋白和包涵体均很少。在摇瓶上对培养基组成和培养条件进行了优化,使得普鲁兰酶产量提高至543.4 U/m L,是优化前的10.8倍。对比考察了短小芽孢杆菌和大肠杆菌表达的重组酶酶学性质,主要在热稳定性和比活上存在一些差异。(4)发现了镁离子具有独特的促进短小芽孢杆菌表达“高活性”普鲁兰酶的作用,并对产生这种促进作用的机制进行了研究。结果表明,在不含镁离子的培养基中,短小芽孢杆菌合成了大量热不稳定且无活性的“普鲁兰酶”;而添加镁离子合成的普鲁兰酶大部分为热稳定的有生物活性的蛋白,相比不添加镁离子,纯酶比活提高了2.9倍,二级结构也发生了显著的变化。研究了镁离子对短小芽孢杆菌形态和相关基因转录水平的影响。结果表明,当短小芽孢杆菌培养于不含镁离子的培养基中时,其外壁蛋白HWP会在稳定期从细胞表面脱落。HWP脱落后引发相关机制,解除对HWP和普鲁兰酶共同的启动子P2的阻遏作用,使得相关基因的转录水平显著提高。在此情况下,普鲁兰酶可能由于合成速度过快而来不及折叠,导致大量热不稳定的无活性的普鲁兰酶形成。镁离子可以阻止HWP从细胞表面脱落,导致P2在整个发酵过程都会受到较强的阻遏作用,普鲁兰酶的合成速度较慢,更利于普鲁兰酶的正确折叠。(5)以摇瓶优化的结果为基础,优化了重组短小芽孢杆菌3-L罐发酵工艺,实现了普鲁兰酶在短小芽孢杆菌中的高效分泌表达。通过分批发酵培养发现,低溶氧和酸性条件对短小芽孢杆菌生长和产酶都极为不利。在分批补料发酵中考察了p H和溶氧对短小芽孢杆菌生长和产酶的影响。结果表明,在最适的p H为7.0、溶氧为30%的条件时,普鲁兰酶活力可达627.5 U/m L。研究了无机氮源对短小芽孢杆菌生长和产酶的影响,发现无机氮源虽然有利于菌体的生长,却对产酶极为不利;短小芽孢杆菌在生长过快时,质粒丢失严重并停止产酶,其形态由短杆状变为球状。因此,在发酵过程中需严格控制无机氮源的添加量。研究了牛肉浸膏浓度对短小芽孢杆菌产普鲁兰酶的影响。结果表明,当牛肉浸膏为40 g/L时,普鲁兰酶活力最高,可达1164.8 U/m L,是优化前的5.3倍。与大肠杆菌相比,以短小芽孢杆菌为宿主表达普鲁兰酶具有分泌效率高、单位细胞生产强度高和耗氧较低等优势。(6)将普鲁兰酶应用于麦芽糖基-?-环糊精的制备,从温度、p H、有机溶剂种类及浓度、底物浓度及摩尔比、加酶量和转化时间等方面优化了麦芽糖基-?-环糊精的生产工艺。结果表明,有机溶剂能够有效提高底物浓度,并大幅度缩短反应时间。在最优条件下,麦芽糖基-?-环糊精的转化率可达48.5%,相比优化前提高了75.7%。