研究背景及目的：　　结核分枝杆菌(结核菌,Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原菌,至今仍然是单一感染因素导致死亡率最多的疾病之一。利福平和异烟肼作为抗结核病治疗的一线药物在临床应用已50余年,耐药率逐年增多,已成为不容忽视的严重问题。目前的研究发现结核菌发生耐药的原因是抗结核药物作用相关基因发生突变导致抗结核药物与药物作用结合位点亲和力下降所致。结核菌培养药敏实验是目前诊断结核菌耐药的金标准,但其培养时间过长、易污染等,不能给临床医师提供相应快速的药敏结果,限制了其临床应用。本研究拟通过对临床标本中分离的利福平(rifampicin,RIF)和异烟肼(isoniazid,INH)耐药的结核菌的耐药特征进行分析,应用分子生物学方法主要包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和高分辨率融解曲线分析(high resolution melting analysis,HRMA)技术检测其引起耐药的常见基因突变情况,分析引起结核菌耐药的常见基因的突变特征及可能的耐药机制,了解HRMA技术检测结果与结核菌培养药敏结果的差异,探讨HRMA在临床推广使用的可能性。　　实验方法：　　1.收集已知药敏结果的临床结核菌分离株60株,其中15株对利福平敏感,45株对利福平耐药,提取DNA采用PCR方法检测其rpoB基因及其其中的利福平耐药决定区(rifampin resistant determination region,RRDR)的利福平耐药相关基因,并通过T-A克隆构建质粒后进行测序,检查其突变情况。　　2.收集已知药敏结果的临床结核菌分离株60株,其中19株对异烟肼敏感,41株对异烟肼耐药,提取DNA采用PCR方法检测其异烟肼耐药相关基因kasA基因、katG基因和inhA基因的启动子区域,并通过T-A克隆构建质粒后进行测序,检查这些基因突变情况。　　3.应用HRMA技术检测237株临床结核菌分离株rpoB、katG基因和inhA基因启动子的突变情况,进而分析判断其耐药机制,并与结核菌临床药敏培养结果进行比较。　　实验结果：　　1.在60株结核菌临床分离株rpoB基因检测中,15株利福平敏感结核菌均未检出突变;45株利福平耐药结核菌中有41株存在突变,突变率为91.1％(41/45)。最易发生突变的位点为531位点,突变率为51.2%(21/41),其次为526、516位点,这3个位点总突变率共占rpoB基因RRDR突变的82.9%(34/41)。　　2.在60株结核菌临床分离株katG基因、kasA基因和inhA基因启动子检测中,19株异烟肼敏感株均未检出突变。41株异烟肼耐药菌株中,katG315位点突变的发生率为70.7%(29/41),inhA基因启动子-15位点发生C-T突变,发生这种突变的菌株占异烟肼耐药株的21.95%(9/41),kasA基因突变率较低。　　3.应用HRMA检测rpoB基因和katG基因、inhA基因的启动子突变情况并与结核菌临床药敏培养结果(金标准)进行比较。发现对于培养结果为利福平耐药的菌株,HRMA技术检测结果符合率为95.4%,特异性为97.6%,敏感性为88.9%;对于培养结果为异烟肼耐药的菌株,HRMA技术检测结果符合率为94.9%,特异性为95.9%,敏感性为92.5%。　　实验结论：　　1.rpoB基因突变是结核菌对利福平耐药的原因之一,其主要突变位点为531、526、516。　　2.katG基因和inhA基因启动子突变是结核菌对异烟肼耐药的原因之一,主要突变形式为katG315(AGC-ACC)和inhA-15(C-T)。　　3.高分辨率融解曲线分析技术与结核菌培养药敏结果具有较好的一致性,具有在临床推广使用的可能。