溶澡弧菌PCR检测及SSCP在毒力株鉴定的应用

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本研究选择gyrB基因为靶基因,以溶藻弧菌种特异性区域设计特异性引物,该引物能将典型溶藻弧菌与其它弧菌或非弧菌细菌区分开来。为了进一步验证该检测技术的准确性,进行为期一年的实样检测。该PCR从874株细菌里检测出77株阳性菌,经过SSCP分析,该77株阳性菌分属于4个分子型,通过对不同分子型的阳性菌株进行抽样测序,结果表明抽选的所有阳性菌株的gyrB基因片段序列与溶藻弧菌的同源性最高,由此认为均为溶藻弧菌,所以该PCR检测技术准确率为100%。基于gyrB基因片段的SSCP分型,可将77株溶藻弧菌分为4个分子型:a、b、c和d型,而基于胶原蛋白酶基因片段的分型,可将77株溶藻弧菌分为13个分子型:A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、G1、G2、H和I型,分辨率得到很大提高。其中A1型是优势分子型,占总数的48.1%。从南油分离的菌株的多态性明显高于特呈和麻斜,25个菌株包含了11个分子型,其中A3、A4、E、G1和G2型,是南油所独有的,A2型也主要分布于南油。从麻斜分离的菌株的多念性也较为丰富,29个菌株可分出7个分子型,其中H和I型是麻斜独有的。从特呈分离的菌株的多态性最低,23个菌株只包含4个分子型。除了D型主要分布于特呈外,其它三个分子型都普遍存在于三个养殖区。根据gyrB和胶原蛋白酶-SSCP型的组合将细菌分组,每个组合代表一种基因遗传型,可分为15个遗传型,然后每组随机挑选若干菌株进行致病性实验。发现溶藻弧菌的毒力与胶原蛋白酶-SSCP分型呈相关关系(r=0.438 p<0.01)。A1、A2、A3、B、C、F、G1和I型的菌株都属于弱毒株,A4、D、E、G2和H型的菌株属于强毒株。由于SSCP的高度灵敏性,有理由相信相同的菌株只能产生唯一的胶原蛋白酶-SSCP指纹图谱,因此这种分子标记技术完全能够鉴定重新分离的株系是否与已有的毒力株相同,从而为准确鉴定溶藻弧菌的毒力株提供有力的证据。
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