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致病性大肠杆菌常引起多种感染,已成为动物和人类感染的重要病原菌之一。而碳青霉烯类药物是人医临床上治疗细菌感染的重要抗生素之一,尽管该类药物在我国尚未批准用于动物疾病治疗,但是仍在动物源大肠杆菌中发现耐碳青霉烯类药物的基因。目前新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase,NDM)是碳青霉烯类水解酶中最广泛流行的一种,不同来源大肠杆菌blaNDM耐药基因的出现及传播,对于公共卫生安全有一定的威胁性。本研究以2007-2018年间的1013株大肠杆菌作为研究对象,采用琼脂稀释法检测这些菌株对15种抗菌药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),结果显示所测菌株对于美罗培南的耐药率最低为0.69%,其次是阿米卡星为8.88%,低于10%。对四环素耐药率最高(72.36%),其次是氨苄西林(71.67%)、萘啶酸(69.79%)、复方新诺明(65.65%)、链霉素(52.52%)这4种抗菌药物。大肠杆菌的来源有人、猪、鸡、鸭、鹅、羊,其中鸡源和猪源大肠杆菌的耐药率普遍较高,人源大肠杆菌的耐药性普遍较低,没有检测到一株对美罗培南耐药,且人源菌株对阿米卡星的耐药率为3.3%。在2007～2009、2010～2012、2013～2015及2016～2018年这四个时间段,发现氨苄西林、四环素、复方新诺明和萘啶酸的耐药率始终维持较高水平。同时大肠杆菌多重耐药现象较为普遍,有632株分离株对3类及以上抗菌药物表现出耐药性,多重耐药率达 62.39%(632/1013)。采用PCR和测序方法对耐美罗培南的菌株检测blaNDM基因,结果显示7株耐药菌全部为blaNDM阳性,分为2个NDM亚型,分别为NDM-1(n=l)、NDM-5(n=6)。尽管从1013株大肠杆菌中检测到的blaNDM阳性菌株数目较少,但是宿主来源广泛,遍及猪源(n=2)、鸭源(n=1)、鹅源(n=2)、鸡源(n=1)、羊源(n=1)。7株阳性菌ST型总共分为5种,分别为ST6388、ST7386、ST10、ST5229,还发现了一株新的ST型,说明NDM在大肠杆菌中的扩散不是以克隆传播为主。同时在7株blaNDM阳性大肠杆菌中,共检测到了 8种质粒型,分别为IncHI2、IncX1、Co1156、IncY、IncX3、IncFIB、IncN和IncFIC,blaNDM-5的阳性菌株均含有IncX3质粒型。挑取C1147、C1588和C1283这3株大肠杆菌进行三代测序,其中C1147来自鹅源大肠杆菌,携带blaNDM1,C1588及C1283均携带blaNDM-5,分别来自于鸭源和鹅源。结果显示blaNDM-1耐药基因存在于IncHI2,而blaNDM-5存在于IncX3质粒上。为进一步了解blaNDM阳性质粒的生物学特征,对这3株大肠杆菌进行接合实验,对不同型的质粒检测耐药表型、稳定性和接合频率。结果显示,IncX3型质粒稳定性较好,接合频率在10-6～10-7,而IncHI2型质粒稳定性也较好,接合频率在10-5左右,接合子对美罗培南的MIC值均提高了 256倍。将上述三代测序菌株中携带NDM基因的质粒分别命名为pC1588.1、pC1283和pC1147质粒,对这些不同阳性质粒进行分析。pC1588.1质粒大小为21351bp,质粒偏小,保留NDM耐药基因常见环境中的部分结构:IS5-blaNDM-5-bleMBL-trpF-dsbC-IS26。pC1283质粒大小为46168 bp,属于IncX3型质粒,结构极为稳定,与大部分携带NDM的IncX3质粒的覆盖率和核苷酸同一性为99%。其blaNDM-5的基因环境为以下典型结构:IS3000-ISAba125-IS5-blaNDM-5-bleMBL-trpF-dsbC-IS26。pC1147质粒大小为 238291bp,属于IncHI2型质粒,骨架结构较为稳定,耐药基因附近的可变区在不同质粒上差异较大,该质粒上blaNDM-1的基因环境为IS26-sul1-emrE-catB-blaNDM-1-bleMBL-trpF-folP-Tn2。综上所述,我国不同源大肠杆菌耐药性严重,尤其是动物源大肠杆菌。本文在受试菌株中检测到7株耐碳青霉烯类药物的阳性菌株,其阳性菌株宿主来源十分广泛,分别来自猪源、鹅源、鸡源、鸭源、羊源这5种动物源,其中blaNDM-5是主要流行的NDM型耐药基因,首次在鹅源大肠杆菌的IncHI2质粒上检测到blaNDM-1。携带NDM的质粒稳定性好、接合能力强,可能导致blaNDM在不同源大肠肝菌中广泛传播。