大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)，属硬骨鱼纲，鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Sciaeni-dae)，黄鱼属。又名黄鱼，为中国传统“四大海产”(大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼)之一，是我国近海主要经济鱼类。本试验主要通过非培养的两种分子方法(PCR-DGGE和克隆文库)与传统细菌分离培养相结合的方法，对大黄鱼肠道及水体中的菌群进行研究，旨在获得大黄鱼肠道优势菌群的构成信息及与水环境之间的相关性。　　 本文首先采用PCR-DGGE方法调查了大黄鱼的消化道菌群结构。该方法主要步骤包括提取基因组DNA，16SrDNAV-3区PCR扩增，变性梯度凝胶电泳，切胶回收测序，在线比对并获得序列号。本试验首先以提取大黄鱼肠道微生物DNA电泳图谱质量作为依据，比较了机械法、酶法、化学法三种不同肠道微生物总DNA的提取方法的优化组合，结果表明酶法和化学法结合提取的总DNA效果最好。本试验中成功测序18个条带，其中5个条带是从海水中分离所得，3个条带属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)，1个条带属于弧菌属(Vibriosp.)，1个条带属于气单胞菌属(Aeromonassp.)；其余的13个肠道条带，5个条带属于代尔夫特菌属(Delftiasp.)，3个条带属于发光杆菌属(Photobacteriumsp.)，3个条带属于不可培养细菌(Unculturedbacterium)，1个条带属于尿原体属(Ureaplasmasp.)，1个条带属于鞘脂罗盘菌属(Sphingopyxissp.)。在13个肠道测序条带中12个属于朊细菌门，其中5个属于β-朊细菌亚门的代尔夫特菌属，显示β-朊细菌亚门的代尔夫特菌属为肠道的优势菌群。　　 其次构建大黄鱼肠道菌群的克隆文库，随机序列测序研究该菌群的组成。以提取的细菌基因组扩增16SrDNAV-3区PCR产物，经胶回收纯化后，使用TaKaRapMTD-19载体建库，蓝白斑筛选，挑选肠道五部分及海水6个文库平板上阳性克隆进行肉汤培养，然后交由上海生物工程技术服务有限公司提取质粒后测序。应用NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)和RDP(http：//rdp.cme.msu.edu/)BLAST程序在线比对测序结果。克隆文库测序序列共54个，其中12个来源于海水，7个属于代尔夫特菌属，1个属于鞘脂单胞菌属，1个属于发光杆菌属，1个属于芽孢杆菌属，1个属于不动杆菌属(Acinetobactersp.)，1个属于鞘脂罗盘菌属(Sphingopyxissp.)；42个来源于肠道，其中25个属于代尔夫特菌属，3个属于不动杆菌属，3个属于支原体属(Mycoplasmasp.)，3个属于鞘脂单胞菌属，2个属于发光杆菌属，1个属于消化链球菌属(Peptostreptococcussp.)，1个属于产液菌属(Aquifexsp.)，1个属于埃希氏菌属(Escherichiasp.)，1个属于丙酸杆菌属(Propionibacteriumsp.)，1个属于甲基杆菌属(Methylobacteriumsp.)，1个属于月形单胞菌属(Selenomonassp.)。这42个肠道序列中36个属于朊细菌门，其中25个属于β-朊细菌亚门的代尔夫特菌属，该结果与PCR-DGGE方法得到的菌株一致，β-朊细菌亚门的代尔夫特菌属为大黄鱼肠道的优势菌群。　　 试验结果显示，从鉴定出的细菌数量看，克隆文库的方法比PCR-DGGE方法具有一定的优势。该方法不但分离出代尔夫特菌属，发光杆菌属等用PCR-DGGE方法得到的菌株，也分离出支原体属，鞘脂单胞菌属，消化链球菌属，丙酸杆菌属等在PCR-DGGE未得到的菌属，其分离出的菌属种类更加丰富。但从细菌种类来看，两种方法各有自己的优势。从海水菌的PCR-DGGE调查结果显示，可以获得芽孢杆菌属，弧菌属，气单胞菌属等，而克隆文库结果中只有芽孢杆菌属，未见弧菌属和气单胞菌属。所以这两种分子方法的结合应用才能弥补各自的缺陷与不足。　　 最后利用传统细菌分离培养的方法筛选健康大黄鱼消化道及海水中的细菌，使分子方法与传统培养方法相互补充、印证，以增强调查结果的可靠性。取大黄鱼肠道的前肠、中肠、中肠内容物、后肠、后肠内容物5部分以及大黄鱼的养殖海水进行细菌分离及鉴定。结果共分离筛选出菌株75个，其中肠道57株，海水18株。57株肠道菌中前肠、中肠、中肠内容物、后肠、后肠内容物分别有13、5、20、9、10株，分别占肠道总数的22.8％、8.8％、35.0％、15.8％、17.6％，结果表明在肠道的不同部位，细菌的数量有一定的差异性。按传统生理生化和16SrRNA两种方法对筛选出的菌株进行鉴定。57株肠道株中，13株属于希瓦菌属(Shewanellasp.)，12株属于不动杆菌属，8株属于假单胞菌属(Psedudomonassp.)，5株属于微小杆菌属(Exiguobacteriumsp.)，4株属于芽孢杆菌属，3株属于嗜冷杆菌属(Psychrobactersp.)，2株属于海单胞菌属(Oceanimonassp.)，2株属于丛毛单胞菌属(Comamonassp.)，2株属于哈夫尼亚菌属(Hafniasp.)，1株属于海球菌属(Oceanisphaerasp.)，1株属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacteriumsp.)，1株属于葡萄球菌属(Staphylococcussp.)，1株属于顿氏菌属(Listonellasp.)，1株属于产碱杆菌属(Alcaligenesp.)，1株属于埃希氏菌属(Escherichiasp.)。18株海水菌菌中6株属于不动杆菌属，5株属于弧菌属，3株属于假单胞菌属，1株属于顿氏菌属，1株属于肠杆菌属(Enterobactersp.)，1株属于芽孢杆菌属，1株属于发光杆菌属。57株肠道菌中有46株为朊细菌门，其中13株希瓦菌属、12株属于不动杆菌属、8株属于假单胞菌属、3株属于嗜冷杆菌属，这37株都属于γ-朊细菌亚门，显示出γ-亚门为大黄鱼肠道优势菌群；18株海水菌中也有17株属于γ-亚门，说明该亚门类的细菌是在海水环境中易于培养的菌群。　　 综合两种分子方法及传统的细菌分离培养方法获得的大黄鱼肠道及其养殖水体的优势菌群的调查结果一致，在大类上确定为朊细菌门，而且大黄鱼肠道中的代尔夫特菌属、不动杆菌属、发光杆菌属及假单胞菌属为优势菌群。并且海水菌中的不动杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、代尔夫特菌属、发光杆菌属也在肠道内调查到，说明海水环境中存在的菌群与大黄鱼肠道中的菌群有一定的相关性。　　 本研究丰富和发展了大黄鱼肠道菌群的信息，提高了对大黄鱼肠道菌群的认识，加深了对大黄鱼患病机理的研究，为进一步应用益生菌来控制养殖水体和鱼体内的致病弧菌、提高养殖动物的存活率和生长速度奠定了理论基础。