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天然橡胶作为重要的工业原料和战略资源,主要来源于巴西橡胶树。橡胶树炭疽病是橡胶树种植园区的主要病害,也是制约橡胶产量的重要因素之一。胶孢炭疽菌是橡胶树炭疽病的病原优势种。为了了解胶胞炭疽菌的致病机理,在前期对橡胶树胶孢炭疽菌进行基因组测序的基础上,预测了效应蛋白编码基因,对其中的六个候选效应蛋白基因进行了克隆和致病性筛选,同时对其中两个编码CFEM类效应蛋白的致病效应蛋白进行了进一步的功能研究。具体结果如下:1.通过RT-PCR技术克隆了胶孢炭疽菌的六个候选效应蛋白基因CgE4,CgE5,CgE6,CgE7,CgE8和CgE35基因。依据同源重组原理,分别构建了这些基因的敲除突变体株△CgE4,△CgE5,△CgE6,△CgE7,△CgE8和ACgE35。致病性分析结果表明,与野生型菌株相比较,△CgE5,△CgE6,△CgE7和△CgE8对橡胶树叶片的致病性减弱,△CgE4和△CgE35对橡胶树叶片的致病性没有发生变化,说明CgE5,CgE6,CgE7,CgE8与胶胞炭疽菌的致病性有关,CgE4和CgE35与胶胞炭疽菌的致病性关系不大。将其中只含有CFEM保守结构域的CgE6和CgE8重新命名为CgCFEM1和CgCFEM2进行进一步的功能研究。2.将CgCFEM1和CgCFEM2的氨基酸序列与其它已知的CFEM效应蛋白的氨基酸序列对比结果表明,CgCFEM1和CgCFEM2与其它CFEM效应蛋白的CFEM保守结构域都含有8个保守的半胱氨酸残基,说明CgCFEM1和CgCFEM2是橡胶树胶胞炭疽菌的CFEM类效应蛋白。系统发育树的分析结果表明,CgCFEM1和CgCFEM2属于不同的分支,说明CgCFEM1和CgCFEM2的亲缘关系较远,可能来源不同。3.为了进一步验证CgCFEM1和CgCFEM2基因在胶胞炭疽菌对橡胶树致病性中的作用,我们又分别构建了两个基因的互补株Res-△CgCFEM1和Res-ACgCFEM2。致病性分析结果表明,WT和互补株之间对橡胶树叶片的致病性没有明显差异,突变株对橡胶树的致病性明显弱于WT和互补株,充分说明正是CgCFEM1和CgCFEM2基因的缺失导致其对橡胶树叶片的致病力显著下降,暗示CgCFEM1和CgCFEM2在胶孢炭疽菌对橡胶树的致病性中发挥作用。4.为了探究CgCFEM1和CgCFEM2在胶胞炭疽菌的遗传学表型中的作用,我们比较了野生型菌株、基因敲除突变株以及互补株的菌丝体生长情况和孢子产量。结果表明,不管是△CgCFEM1和△CgCFEM2,它们的菌丝体生长速率与野生型和各自的互补株之间,没有明显差异;△CgCFEM1和△CgCFEM2的孢子产量明显低于野生型菌株及其互补株,但野生型菌株及其互补株之间不存在明显差异。以上结果说明CgCFEM1和CgCFEM2与胶孢炭疽菌的孢子产量有关,与胶孢炭疽菌的生长关系不大。5.铁元素在植物与病原微生物的互作中发挥重要作用。已有的研究证明在动物病原真菌中,CFEM类效应蛋白与铁的吸收有关。为了探究CgCFEM1和CgCFEM2与胶胞炭疽菌的铁吸收是否有关,我们分析了不同铁离子条件下CgCFEM1和CgCFEM2的表达情况以及△CgCFEM1和△CgCFEM2菌丝体中的铁含量。结果表明,与正常条件下(Fe2+)的表达相比较,Fe3+能够诱导CgCFEM1和CgCFEM2基因的上调表达,但缺铁条件下CgCFEM1的表达明显上调,CgCFEM2的表达明显下调。同时,在只含Fe2+(正常生长)条件下,△CgCFEM1菌丝细胞中的铁含量相比WT明显下降,△CgCFEM2则明显增加,而在只有Fe3+的条件下,与WT相比,△CgCFEM1菌丝体中的铁含量无明显差异,△CgCFEM2中的铁含量则明显下降。推断CgCFEM1可能与Fe2+的吸收相关,而CgCFEM2可能与Fe3+的转化相关。6.通过橡胶树原生质体瞬时表达系统分析了 chitin处理后表达CgCFEM1和CgCFEM2的橡胶树原生质体细胞中活性氧积累的变化情况,发现CgCFEM1和CgCFEM2蛋白均可以抑制由chitin引起的PTI反应。7.构建CgCFEM1-GFP和CgCFEM2-GFP融合基因的瞬时表达载体,通过橡胶树叶片原生质体细胞瞬时表达系统对CgCFEM1和CgCFEM2蛋白进行了亚细胞定位分析,结果发现CgCFEM1和CgCFEM2蛋白分别定位于细胞质和细胞膜系统中,至于具体位置尚需进一步共定位检测加以确认。总之,本研究中我们克隆了 6个候选效应蛋白编码基因并从中筛选出4个致病相关效应蛋白编码基因。随后,我们对其中两个致病相关的CFEM类效应蛋白编码基因进行了进一步的功能分析。结果表明,CgCFEM1和CgCFEM2不仅参与调节胶孢炭疽菌的孢子产量和铁的吸收转化,而且通过抑制由chitin引起的PTI反应在胶孢炭疽菌对橡胶树的致病过程中发挥重要作用。本研究为阐明胶孢炭疽菌致病机理提供了新的证据。