背景细胞凋亡是一种保守的程序性死亡方式。凋亡异常会导致自身免疫病、神经退行性疾病、癌症等多种疾病的发生。效应Caspase（Caspase 3、7）是凋亡的主要执行者,可以剪切多种胞内蛋白,从而改变它们的稳定性、活性或功能。对凋亡的调控可以发生在效应Caspase激活的上游或下游。CIZ1是核基质蛋白,参与DNA复制和细胞周期调控。我们实验室之前的研究发现在果蝇翅成虫盘中,敲低Ciz1抑制细胞在效应Caspase激活后的存活。此外,我们还观察到人CIZ1在细胞凋亡过程中被剪切。本研究利用人卵巢癌细胞系探究了 CIZ1在凋亡过程中被剪切的机制及其在细胞凋亡中的作用。目的探究CIZ1在凋亡过程中被剪切的机制,明确CIZ1及其剪切对细胞凋亡的影响。方法和结果1.凋亡过程中CIZ1在第655位天冬氨酸处发生Caspase 3介导的剪切。1)我们利用慢病毒构建了过表达CIZ1的HEY、A2780细胞系（HEY-CIZ1和A2780-CIZ1）,并用 TRAIL 和 staurosporine（STS）诱导细胞凋亡,通过 Western blot发现细胞凋亡过程中过表达的CIZ1被剪切。STS处理HEY、A2780细胞也可以引起内源表达的CIZ1剪切。Caspase抑制剂处理可以抑制TRAIL或STS引起的CIZ1剪切,说明凋亡过程中CIZ1的剪切依赖于Caspase的活性。2)我们利用siRNA分别干扰HEY-CIZ1细胞中Caspase 3、7的表达,发现敲低Caspase 3抑制CIZ1在STS或TRAIL处理后的剪切。3)我们通过序列分析预测CIZ1的剪切可能发生在第655位天冬氨酸。为此,我们分别构建了缺失第554-713位氨基酸的CIZ1（CIZ1-DELE）和第655位天冬氨酸突变为丙氨酸的CIZ1（CIZ1-MUT）的表达载体,并利用这两个载体分别构建了相应的过表达细胞系,发现STS或TRAIL处理后CIZ1-DELE和CIZ1-MUT均不发生剪切,说明凋亡过程中,CIZ1在第655位天冬氨酸处被剪切。2.CIZ1促进卵巢癌细胞抵抗凋亡。为了明确CIZ1在卵巢癌细胞凋亡中的作用,我们利用携带shRNA-CIZ1和shRNA-control的慢病毒构建了 CIZ1敲低的HEY及相应的对照细胞系,并利用CRISPR-Cas9技术构建了敲除CIZ1的HEY及相应的对照细胞系。在利用qRT-PCR、Western blot检测敲低、敲除效率后,我们用STS处理细胞,通过检测PARP1剪切、Annexin V染色以及TUNEL实验分析CIZ1敲低或敲除对细胞凋亡的影响,发现抑制CIZ1表达不影响卵巢癌细胞在正常培养条件下的存活,但增加了 STS诱导的细胞凋亡,说明抑制CIZ1表达增强了卵巢癌细胞对凋亡刺激的敏感性。向CIZ1敲除细胞中回补全长CIZ1可以拯救CIZ1敲除引起的凋亡敏感性增加。这些结果说明CIZ1可以促进卵巢癌细胞抵抗凋亡。3.CIZ1对卵巢癌细胞凋亡抵抗的调控依赖于Caspase 3介导的剪切。为了明确Caspase 3介导的CIZ1剪切对凋亡的影响,我们向CIZ1敲除细胞中回补无法被剪切的CIZ1-MUT,发现回补CIZ1-MUT不能拯救CIZ1敲除引起的凋亡敏感性增加,说明Caspase 3介导CIZ1的剪切是细胞抵抗凋亡所必需的。4.CIZ1剪切产生的N端片段促进卵巢癌细胞对凋亡刺激的抵抗。Caspase 3介导CIZ1剪切产生一个100 kDa的N端片段和一个20 kDa的C端片段。为了明确Caspase 3介导的CIZ1剪切如何调控细胞对凋亡刺激的响应,我们分析了分别过表达N端片段和C端片段对STS诱导的细胞凋亡的影响,发现过表达N端片段可以减少STS诱导的凋亡,而过表达C端片段不影响STS诱导的凋亡,说明CIZ1剪切产生的N端片段可以促进卵巢癌细胞抵抗凋亡。结论本研究发现CIZ1促进卵巢癌细胞抵抗凋亡。在凋亡刺激下,激活的Caspase 3介导CIZ1剪切产生的N端片段可以促进细胞的存活。