燕麦内参基因的筛选及裸粒相关基因AsMADS1的克隆

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作为八大粮食作物之一,燕麦具有很高的营养价值和保健功能。根据外稃的差异,燕麦一般被分为皮燕麦和裸燕麦,且这一差异直接影响燕麦的产量、加工和利用,因此克隆调控这一性状的基因,对于解析皮、裸燕麦外稃发育机制及燕麦遗传改良具有重要的意义。MADS-box家族基因是调控高等植物花器官发育的关键基因,在多个植物中已被报道,但燕麦中MADS-box家族基因的鉴定及功能还未见报道。本研究在对燕麦的MADS-box基因家族进行全基因组鉴定与分析的基础上,以六倍体皮、裸燕麦为实验材料,克隆了水稻外稃发育调控基因OsMADS1的同源基因AsMADS1,并对其表达和结构进行了分析,为揭示皮、裸燕麦外稃发育机制奠定了基础。此外,鉴于目前对燕麦内参基因的研究还不够完善,故本研究还对不同时期、不同组织燕麦内参基因进行了筛选与评价。主要研究结果如下:1、通过拟南芥、玉米、水稻传统的内参基因与异源六倍体燕麦基因组数据库进行比对筛选出13个候选内参基因,在燕麦不同时期、不同组织的10个样品中进行实时荧光定量PCR分析,利用Ge Norm、Norm Finder和Bestkeeper三种计算方法综合评估13个基因表达的稳定性。最终确定了AsUCH-4D2RF、AsFPGS-1D1RF、AsGAPDH-7C2RF和AsFPGS-1D2RF组合,AsFPGS-1D2RF和AsUCH-4D2RF组合,AsUCH-4D2RF和AsWDR-3C1RF组合,AsFPGS-1D1RF和AsFPGS-1D2RF组合,AsFPGS-1D1RF和AsTUA5-2C1RF组合,AsFPGS-1D1RF和AsTUA5-2C3RF组合以及AsUCH-4D2RF和AsFPGS-1D1RF组合分别作为燕麦所有样品组、苗期组、分蘖期组、成熟期组、根组、茎组和叶组的最优内参基因组合。此外,本研究还对燕麦亚基因组中直系同源基因进行稳定性分析发现,它们的稳定性存在差异。因此,在多倍体物种内参基因选择时,区分亚基因组直系同源基因是必要的考虑因素。2、对燕麦MADS-box基因家族分析鉴定发现:燕麦基因组中共有104个MADS-box基因,其中AsMADS101基因根据水稻的MADS-box基因分类信息未被分类出,剩余103个MADS-box基因共分为两大类Ⅰ型(7个)和Ⅱ型(96个)。其中Ⅰ型可进一步分为Mα(5个)、Mβ(2个)、Mγ(0个),Ⅱ型可进一步分为MIKC(91个)和MIKC*(5个)。所有MADS-box蛋白中都有MADS结构域的存在,共有6个结构域,并且这104个基因随机分布在22条染色体上。3、在燕麦1D、5A、7C染色体上均存在水稻OsMADS1的同源基因,分别将其命名为AsMADS1-1D、AsMADS1-5A和AsMADS1-7C。对三个基因进行结构分析,三者与OsMADS1基因高度同源,且均具有典型的MADS-box结构域;AsMADS1-5A和AsMADS1-7C在皮、裸燕麦中相同,而AsMADS1-1D在皮、裸燕麦存在5个SNP,且其中1个SNP位于MADS-box基因的保守功能域处。又对AsMADS1-1D在燕麦不同组织中的表达发现,AsMADS1-1D在穗中特异性表达,但在皮、裸燕麦中表达没有差异。因此,我们推测,AsMADS1-1D基因第23个氨基酸由K突变为了T可能是导致裸燕麦“白燕2号”和皮燕麦“Banner”在外稃上的差异。
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