柚苷酶是一种由α-L-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.40）和β-D-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）组成的酶系，它可以特异性地将柚皮苷水解成柚苷素，在柑桔类水果加工、食品增香、工业制备鼠李糖等方面具有重要用途。在前期研究中，本研究室选育获得了柚苷酶的高产菌株--黑曲霉DB056，建立了柚苷酶高产发酵工艺，本论文主要对黑曲霉DB056柚苷酶的分离纯化进行研究，研究内容包括柚苷酶活性检测方法的建立、柚苷酶的分离纯化与酶学性质、α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化与酶学性质、β-D-葡萄糖苷酶的分离纯化与酶学性质等几个方面。主要实验结果如下：（1）用Waters1525液相色谱仪及Symmetry C18色谱柱测定柚苷酶活力的流动相流速为0.4mL/min；流动相中38%为有机相，62%为超纯水，有机相中30%为甲醇，70%为乙腈；紫外检测波长为280nm；柱温为35℃；走样时间为28min；柚皮苷和柚皮素在50-300μg/mL的浓度范围内具有良好线性关系，R2分别为0.9964、0.9999；柚皮苷和柚皮素的方法检出限分别为0.00109μg/mL和0.0046μg/mL，定量检出限分别为0.00363μg/mL和0.01534μg/mL；柚皮苷和柚皮素的回收率分别为96.85%-101.65%和88.83-100.66%；在酶液稀释比例为0.50-1.0之间时，α-L-鼠李糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶和柚苷酶的酶活回收率分别为100-102.57%、100-108.30%、100-116.43%。（2）通过硫酸盐沉淀、离子交换层析及凝胶层析分离得到了柚苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶，比活力分别为1716.41U/mg、8256.14U/mg和662.07U/mg，纯化倍数分别为17.52、77.68和68.35倍。其中，α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的分子量约分别为90kDa和95kDa。（3）柚苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的最适pH值范围分别为4.0-5.0、5和4.5-5.0，稳定的pH值分别为4.5-5、3.5-7.5和5.0-6.0；最适作用温度分别为50℃、50-55℃和55℃，它们在低温条件下稳定性好。（4）Ag⁺、Hg²⁺对柚苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性都有强烈的抑制作用，Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺、Cu²⁺对α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶具有强烈的抑制作用，Zn²⁺、Mn²⁺和1mmol/L Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺对β-D-葡萄糖苷酶有抑制作用而5.0mmol/L的Fe²⁺、Al³⁺对柚苷酶显示出了抑制作用；0.1mmol/L的Ca²⁺、K⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺可提高柚苷酶的活力，Na⁺、Ba²⁺对α-L-鼠李糖苷酶的活力有促进作用，K⁺、Ba²⁺和5mmol/L Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺对β-D-葡萄糖苷酶的酶活性有促进作用。（5）α-L-鼠李糖苷酶对芸香苷、柚皮苷和对硝基酚-α-鼠李糖苷有水解性，以柚皮苷为底物，它的Km和Vm分别为157.24μg/mL和588.24μg/（mL·min）；β-D-葡萄糖苷酶对七叶苷、熊果苷、对硝基苯酚-β-葡萄糖苷、杨梅苷、普鲁宁有一定的水解性，以普鲁宁为底物，它的Km和Vm分别为550.33μg/mL和1670μg/（mL·min）。本文建立了柚苷酶活性测定的HPLC方法，分离纯化了黑曲霉DB056的柚苷酶及其活性组分，阐明它们的基本酶学性质，为生产柚苷酶制剂及开发其应用技术奠定了基础。