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目的：手足口病是由多种肠道病毒引起的一种常见儿童传染病,在2008年纳入我国法定报告的丙类传染病。多数手足口病患儿临床症状和体征轻微,以发热及手、足口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征,少数患儿可并发无菌性脑膜脑炎、呼吸道感染、心肌炎等致死性并发症。手足口病给儿童的健康造成较为严重的威胁。本研究的目的：1.调查2010-2013年临床确诊手足口病患者肠道病毒的感染情况；了解浙江省手足口病肠道病毒的流行病学特征；明确影响肠道病毒检出率的影响因素,为手足口病的有效防控提供科学依据。2.通过手足口病CoxA6病毒VPl基因进行核苷酸序列测定,分析CoxA6病毒分离株的基因特征,进一步了解手足口病CoxA6病毒的分子生物学性状及与其他地区流行的手足口病CoxA6病毒毒株的遗传进化距离,探讨我省手足口病CoxA6病毒变异的分子基础。为CoxA6病毒的变异变迁研究打下基础。方法：1.临床标本检测及病毒分离：采用一步法荧光定量RT-PCR探针法和普通PCR或RT-PCR法对临床确诊手足口病患者的标本进行肠道病毒、EV71、CoxA16、 CoxA6 CoxA10病毒检测,将本实验室部分CoxA6病毒检测阳性标本接种到横纹肌瘤细胞(RD)进行病毒的分离培养。2.分子生物学实验：对分离毒病株采用EV71、CoxA16、CoxA6病毒核酸检测试剂盒进行验证,并使用自己设计的特异性引物分别对毒株进行扩增；对于病毒核酸检测为阳性的标本,进行普通RT-PCR扩增,将PCR产物送杭州华大基因有限公司测序。3.生物信息学分析：参考CoxA6的代表株以及中国大陆其他地区测定的手足口病Cox A6 VP1基因序列,应用DNASTAR、DANMAN等生物学软件对浙江地区手足口病病毒核苷酸序列进行系统的分析。结果：1.人口学特征从2010年1月1日至2013年12月31日共有4218例手足口病诊断病例,在这些手足口病临床诊断病例中男性患者2686例,女性患者1532例,男/女性别比例为1.75(2010年男/女：1.66：1,2011年男/女：2.16：1,2012年男/女：1.58：1,2013年男/女：1.59：1)；绝大多数病例集中在5岁以下儿童(93%),其中以1-<3岁组最多(52%),并且患儿中散居儿童占主要部分,其次为幼儿园儿童。2.时间分布从2010年至2013年临床诊断手足口病数据可见手足口病虽然全年可发,但4-6月发病例数明显开始上升(2013年3-6月),2010年和2011年发病高峰出现在5月,2012年和2013年发病高峰出现在6月。2010和2011年浙江省手足口病发病率的时间分布相似,一年内有一个发病高峰。2012年和2013年9月份出现发病次高峰。3.病原分布肠道病毒总检出率为71.08%。2010年检出肠道病毒核酸阳性样本873例,其中EV71阳性454例(52.0%),CoxA16阳性235例(26.9%),其他肠道病毒阳性184例(21.1%)。2011年检出肠道病毒核酸阳性的样本有839例,其中EV71阳性378例(45.1%),CoxA16阳性252例(30.0%),其他肠道病毒阳性209例(24.9%)。2012年,检出肠道病毒核酸阳性的样本有595例,其中EV71阳性240例(40.3%),CoxA16阳性186例(31.3%),EV71、CoxA16同时阳性35例(5.9%),其他肠道病毒阳性134例(22.5%),显示2010年至2012年优势病原为EV71,其次为CoxA16。2013年,检出肠道病毒核酸阳性的样本有711例,其中EV71阳性142例(20.0%),CoxA16阳性20例(2.8%),其他肠道病毒阳性549例(77.2%),结果显示2013年手足口病优势病原体为其他肠道病原体,EV71、CoxA16检出率明显下降(P<0.05),我们选取2013年的549例其他肠道病毒阳性样本中的267例进行CoxA6和A10核酸检测,结果显示：其中CoxA6阳性137例(51.3%,137/267),CoxA10阳性16例(6.0%,16/267)4.不同类型标本肠道病毒核酸检出情况2010年至2013年,共采集4246份样本,其中咽拭子1421份、粪便2803份、疱疹液22份。咽拭子肠道病毒核酸检出率为65.1%；疱疹液肠道病毒核酸均为阳性,阳性检出率为100%；粪便标本肠道病毒核酸检出率为76.2%,疱疹液病毒检出率最高,其次为粪便,咽拭子病毒检出率较低。5.我们共分离CoxA6病毒株各15株,并选择4株进行基因序列测定和扩增,核苷酸序列进行同源性比对,同源性为：89.3-99.6%；分别将四株序列在NCBI上进行Blast同源性检索,最终我们选取了34株序列(全部来自GenBank中)进行建树进化分析,分析发现其中一株CA6-1-43与其他三株在树形上的位置相距较远。结论：1.2010-2012年,浙江省手足口临床诊断病例的优势病原体为EV71,其次为CoxA16;2013年开始为其他肠道病毒为主(即非EV71、Cox16),其中Cox6阳性率上升显著,手足口病优势病原体发生变化。2.2010-2013年,手足口病均在5-6月期间出现发病高峰,2012年和2013年在9月份出现发病次高峰,说明手足口病发病和流行具有明显的季节性,夏季和冬季手足口病病例数下降,说明病毒的流行传播可能受到极端温度的限制；手足口病发病人群以<5岁的散居儿童为主,男女性别的发病率男性大于女性。3. Cox A6毒株基因同源性及系统进化树分析表明,浙江地区流行Cox A6毒株彼此之间存在一定差异,其中Cox A6-1-43与其它三株的同源性比较结果低于90%,考虑可能为异地迁入。