第一部分BDNF对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响目的：观察BDNF对小鼠未成熟卵母细胞的体外成熟及胚胎发育能力的影响，并选择BDNF作用于小鼠未成熟卵母细胞的最适合浓度。方法：实验分三个部分。首先在常规体外成熟培养液(以α-MEM为基础培养液，添加10％的FBS和0．2IU/ml的卵泡刺激素FSH)中，添加不同浓度(0、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml)的BDNF，培养小鼠卵丘-卵母细胞复合物(CEOs)，成熟后进行体外受精，观察卵母细胞成熟率、受精率和囊胚形成率，从中选择BDNF作用于小鼠未成熟卵的最佳浓度(5ng/ml)；其次，在常规体外成熟培养液中除去FSH条件下，改变FBS的浓度(0、5％、10％)，添加BDNF(0、5ng/ml)，观察不同FBS条件下，BDNF对小鼠CEOs体外成熟及发育能力的影响，明确BDNF与FBS对小鼠未成熟卵作用的相互关系。最后将CEOs脱去卵丘细胞，用添加5％的FBS的体外成熟培养液培养，观察BDNF5ng/ml的添加与否对裸卵体外成熟及发育能力的影响，从而了解BDNF对未成熟卵的作用是否需要卵丘细胞的介导。结果：当体外成熟培养液中含有FSH和10％的FBS时，与体外成熟对照组比较，BDNF各浓度组卵母细胞的成熟率和受精率差异均无统计学意义，但BDNF5ng/ml组的囊胚形成率(75．00%)显著高于体外成熟对照组(56．63%)，而接近体内成熟组(76．92％)。因此，BDNF5ng/ml是促进未成熟卵成熟和囊胚发育的最佳浓度；当培养液中仅含FBS(5％或10％)时，与相应的对照组比较，卵母细胞成熟率和受精率差异无统计学意义，但BDNF显著提高囊胚形成率(FBS5％：21．51％vs．9．09%；FBS10％：31．76％vs．18．9％)；当培养液中不含FBS、FSH时，虽然两组均无囊胚形成，但BDNF显著提高了卵母细胞的受精率(29．72% vs．10．57％)。同样，当BDNF作用于未成熟裸卵时，虽然不影响成熟率和受精率，但将囊胚形成率提高了3倍(18．18％vs．4．65％)。结论：BDNF作用于小鼠未成熟卵母细胞的最适合浓度为5ng/ml。在不同的体外成熟培养条件下，BDNF不影响卵母细胞成熟率，也无须卵丘细胞的介导，直接作用于卵母细胞，促进小鼠卵母细胞质的发育，提高卵母细胞的发育能力。第二部分BDNF对体外成熟的卵母细胞纺锤体形态；和皮质颗粒分布的影响目的：纺锤体和皮质颗粒是卵母细胞内的重要细胞器，纺锤体的形态、大小、位置以及皮质颗粒的分布都常用作评价卵母细胞质量的指标。在小鼠未成熟卵体外培养过程中，研究BDNF对纺锤体形态、大小、位置以及皮质颗粒分布的影响，了解BDNF在细胞水平对卵母细胞作用的具体环节。方法：将卵丘-卵母细胞复合物分别培养在两种α-MEM体外成熟培养液中(均含5％FBS，不添加或添加5ng/mlBDNF)，收集体外培养2h、4h、8h、12h、16h的卵母细胞，同时取HCG注射后2h、4h、8h、12h、16h的体内成熟卵母细胞作为正常对照。用免疫荧光法标记微管和中心粒周蛋白，Hochest33258标记染色质，FITC-LCA标记皮质颗粒，共聚焦显微镜下分别观察卵母细胞减数分裂进程、纺锤体形态和皮质颗粒分布，并进行比较。结果：体内和体外成熟的卵母细胞在减数分裂进程、纺锤体形态和皮质颗粒分布上表现出显著的差异。与体外成熟卵母细胞比较，体内成熟的卵母细胞减数分裂过程表现出高度的同步性。BDNF不影响卵母细胞IVM2h减数分裂的恢复和IVM16h的成熟率，但影响了减数分裂的中间过程。在IVM8h和12h，BDNF处理组和对照组卵母细胞所处的减数分裂阶段存在明显的差异。体内成熟卵母细胞减数分裂中期(包括MⅠ和MⅡ)的纺锤体呈两端逐渐变细的“纺锤状”，微管排列紧密，胞质中存在较多的微管形成中心，纺锤体100%靠近卵膜；体外成熟的卵母细胞的纺锤体两端宽大，呈“桶状”，微管排列稀疏，胞质中的微管形成中心较少，纺锤体靠近卵膜的比例明显降低。在体外成熟培养液中添加BDNF的条件下，卵母细胞MⅠ纺锤体的宽度和表面积比对照组明显减少(P＜0．05)；微管形成中心明显增多(P＜0．01)，MⅠ和MⅡ期纺锤体靠近卵膜的比例明显增加(MⅠ：65．79% vs．34．29；MⅡ：71．939% vs．43．24%。P＜0．01)。卵母细胞体内和体外成熟过程中，皮质颗粒重排的时机不同，体内成熟卵母细胞在皮质颗粒分布方面同样表现出高度的一致性。而在卵母细胞体外成熟的BDNF处理组和对照组中，尽管IVM4h和16h皮质颗粒分布相似，但在IVM8h和12h，皮质颗粒分布的类型在统计学上存在明显的差异(P＜0．05)。IVM8h，BDNF处理组出现第一次无皮质颗粒区(StageⅣ)的卵母细胞(31．25％)明显多于对照组(12．50%)；IVM12h，BDNF处理组出现皮质颗粒在第一极体排出时形成的分裂沟中聚集(StageⅤ)的卵母细胞多于对照组，但对照组出现第二次无皮质颗粒区(StageⅥ)的卵母细胞多于BDNF处理组。结论：BDNF在一定程度上改变了卵母细胞减数分裂进程，纺锤体的形态、定位以及皮质颗粒的重排。BDNF对减数分裂中期纺锤体形态和定位的改善可能是其促进卵母细胞质成熟的一个重要原因。第三部分BDNF作用于体外成熟的卵母细胞的信号转导途径目的：通过检测体外成熟过程中卵母细胞和卵丘细胞内蛋白激酶B(PKB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化的变化，来了解BDNF对PKB和MAPK途径的影响，初步探索BDNF促进卵母细胞成熟的信号转导途径。方法：将卵丘-卵母细胞复合物分为三个组：α-MEM中添加5％的FBS(对照组)；α-MEM中添加5％的FBS和5ng/mlBDNF(BDNF处理组)；α-MEM中添加5％的FBS、5ng/mlBDNF和100nMK252a(一种Trk受体抑制剂，K252a处理组)。分别进行体外培养，在培养0h、1h、2h、3h、6h、16h收集卵母细胞和卵丘细胞。用Western Blot方法检测卵母细胞和卵丘细胞内PKB和MAPK的磷酸化变化并进行比较。结果：在卵母细胞内BDNF增强了PKB的活性，延长了PKB的激活时间。而在Trk受体抑制剂K252a的作用下，PKB的活性被完全抑制。因此，BDNF对卵母细胞内PKB的激活是通过与受体TrkB结合后产生的效应。BDNF也在一定程度上增强了MAPK的活性，然而并不是TrkB的受体后效应，因为K252a不能抑制MAPK的激活。在卵丘细胞内，BDNF延长了PKB和MAPK活性持续的时间。K252a能短暂地抑制了卵丘细胞内PKB的活性，但对MAPK的活性无影响。IVM16h，对照组卵丘细胞内PKB和MAPK的蛋白总量下降，BDNF处理组则保持PKB和MAPK的蛋白总量不变。结论：BDNF增强了卵母细胞内PKB和MAPK的活性，延长了卵丘细胞内PKB和MAPK的激活时间。而这可能与BDNF改善体外成熟的卵母细胞质的成熟有关。在卵母细胞，PKB途径是BDNF与受体TrkB结合的信号转导途径之一，而MAPK途径则不是BDNF直接激活的信号转导途径。