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(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)是一种重要的手性药物中间体,可用于合成HGM-CoA还原酶抑制剂和β-1,4-二氢吡啶类钙离子通道阻断剂等药物,具有重要的应用价值。 首先,从实验室保藏的七株酵母菌株中筛选出具有较高还原能力和手性选择性的菌株——木兰假丝酵母(Candida magnoliae)。优化其还原反应条件,结果表明,25g/L木兰假丝酵母在30℃,以10g/L的葡萄糖为辅助底物的缓冲溶液(pH6.0)中能将12.1g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)还原为(S)-CHBE,此时产物得率为87.5%,对映体过量值(e.e.值)为76.4%。当细胞量增至45g/L时产物得率和e.e.值分别提高至99.2%和85.2%。提高底物浓度后,发现单相反应过程存在比较严重的底物及产物抑制。底物分批加入可以部分解除底物抑制,但产物抑制作用仍然存在。 为减轻产物抑制的影响,研究Candida magnoliae两相体系中不对称还原反应,并优化其还原反应条件。结果表明,在水/乙酸丁酯两相体系中,30℃时在添加50g/L葡萄糖的缓冲溶液中,100g/L的木兰假丝酵母可在滴加底物条件下将60.5g/L的COBE还原为(S)-CHBE,产物得率为93.8%,e.e.值为85.7%。 此外,还研究了经热处理的木兰假丝酵母催化COBE立体选择性还原反应。新鲜木兰假丝酵母菌株经热处理(55℃、30min)后具有高度的立体选择性,且不受还原条件的影响,产物为(S)型,e.e.值大于99%。且此过程中不需添加任何商业辅酶NADP~+/NADPH及葡萄糖脱氢酶(GDH)。在水/乙酸丁酯两相体系中,经55℃加热30min处理后的Candida magnoliae(100g/L),可将60.5g/L的COBE还原为(S)-CHBE,产物得率为58.5%,其e.e.值大于99%。 最后,构建了具有较高羰基还原酶酶活的大肠杆菌菌株E.coli M15(pQE30-car)和较高葡萄糖脱氢酶酶活的大肠杆菌菌株E.coli M15(pQE30-gdh0310)。优化其培养条件和不对称还原反应条件,30℃时50g/L的E.coli M15(pQE30-car)和50g/L的E.coli M15(pQE30-gdh0310)在100mM,pH6.0的磷酸盐缓冲液中能将12.1g/L的COBE还原为(S)-CHBE,其产物得率为78.4%,其e.e.值大于99%。在水/乙酸丁酯两相体系中,100 g/L的E.coli M15(pQE30-car)和100 g/L的E.coli M15(pQE30-gdh0310),在pH6.0的磷酸盐缓冲液中(50g/L的葡萄糖)振荡反应(100 r/min)时,可将60.5g/L的COBE转化为(S)-CHBE,产物得率为42.0%,其e.e.值大于99%。