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研究目的根据生物信息学分析筛选甲状腺乳头癌(Thyroid papillary carcinoma,PTC)与甲状腺滤泡状癌(Thyroid follicular carcinoma FTC)之间的差异表达基因以探究甲状腺滤泡状癌高转移率的潜在原因,并结合生存分析就差异基因对甲状腺滤泡状癌的预后影响进一步筛选,通过组织验证以及细胞实验验证其在FTC细胞中的生物学功能。结合KEGG富集分析探究导致FTC与PTC恶性生物学行为的主要差异信号通路,并对其在FTC中发挥功能进行验证,进一步明确影响生存的差异表达基因与该信号通路之间的调控关系。研究方法1.数据库检索全面筛查GEO数据库,对相关数据集进行详细阅读,将符合纳入标准的数据集进行下一步处理。运用GEO2R功能,分别对筛选出的数据集进行分析,提取其中甲状腺滤泡状癌与乳头状癌的差异表达基因,并通过Venn图的形式展现纳入的三个数据集共同的差异表达基因。cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)是一个基于TCGA数据库探索多维癌症基因组数据的开放平台,其中包括516个样本在内的甲状腺癌患者的生存信息。总体生存率(OS)采用Cox回归(比例风险回归)模型,依据性别、年龄和肿瘤分期等因素进行调整。计算并显示对数秩P值。根据生存率进一步筛选确定对于FTC预后起重要作用的差异表达基因,并进一步进行组织验证和生物学功能验证。2.临床组织验证取得纳入标准患者知情同意后,通过山东大学齐鲁医院伦理委员会的审核。从山东大学齐鲁医院甲状腺室获取FTC、PTC患者的病理组织以及患者完善的临床资料,免疫组化以及RT-PCR验证DUSP5在FTC以及PTC的表达情况。3.体外实验探讨DUSP5介导FTC133迁移增殖作用人甲状腺滤泡癌细胞系(FTC-133)分为以下4组:A:DUSP5过表达质粒转染FTC-133(DUSP5);B:空载对照质粒转染FTC-133(NC);C:DUSP5小干扰转染 FTC-133(siDUSP5);D:空载对照小干扰转染 FTC-133(siNC)。western blotting和qRT-PCR检测DUSP5的干预效果。根据Transwell检测细胞迁移、侵袭能力,EdU检测细胞增殖能力,western blotting检测迁移相关蛋白分子的表达情况。4.KEGG富集分析明确FTC与PTC差异基因所富集关键通路并进行体外验证进一步通过对三个数据集差异表达基因进行KEGG富集分析发现,MAPK信号通路在三个数据集中均富集显著,提示我们MAPK信号通路在介导FTC与PTC生物学行为差异方面发挥重要作用。我们分别应用MAPK信号通路中三个亚通路的抑制剂以Edu、Transwell验证三个亚通路(ERK MAPK,JNK,p3 8 MAPK)在FTC细胞中发挥的作用。进一步以western blotting检测干预DUSP5的表达后MAPK信号通路的三个亚通路的激活情况,随后Edu、Transwell明确DUSP5与其激活的MAPK亚通路对细胞增殖、迁移以及侵袭的影响。5.统计学分析统计学分析:数据以均数±标准差(mean±SE)表示,使用SPSS 22.0统计软件进行统计分析,两组间数据的比较使用非配对t检验。若P<0.05,则认为有统计学意义(双侧),若P<0.01,则认为有显著统计学意义(双侧)。研究结果1.数据库综合分析结果:GEO数据库筛选发现GSE27155,GSE53157和GSE29315三个数据集符合纳入标准,共包含26个FTC样本,67个PTC样本,经GEO2R工具进行差异表达基因分析并以Venn进行汇总(图1.2),发现有26个基因(见表1)在这三个数据库中均差异表达,筛选流程见图1.1。这26个差异表达基因中有2个在FTC中表达上调,24个表达下调(图1.3)。对26个共同差异表达基因以cBioPartol数据库中甲状腺癌病人的临床资料进行生存相关分析,我们发现这26个共同差异表达基因中DUSP5对于甲状腺癌的生存率有明显的影响(图1.4)。2.验证病理组织DUSP5的表达情况:免疫组化结果显示,在FTC病理组织中DUSP5表达较少,而PTC病理组织中DUSP5大量表达(图2.2,图2.3)(P<0.05)。在组织芯片中也得到相同的结果(图 2.1)(P<0.05)。3.细胞转染DUSP5:转染DUSP5过表达质粒、小干扰以及对应空白对照于FTC-133细胞,western blottingting、RT-PCR验证转染效果,结果显示:与空载对照质粒组相比,过表达质粒组DUSP5在蛋白水平和mRNA水平均表达增加(P<0.05),小干扰与对照组相比DUSP5表达降低(图3.1)(P<0.05)。4.EdU法检测细胞增殖、迁移与侵袭能力:与空白对照组相比,DUSP5过表达组细胞增殖率明显减少(P<0.05);DUSP5干扰组与对照组相比细胞增殖率增加(图4.1)(P<0.05)。抑制DUSP5表达,细胞迁移、侵袭数量明显较对照组多(P<0.05);而DUSP5过表达组细胞迁移、侵袭数量减少(图4.2,图4.3)(P<0.05)。5.细胞迁移侵袭相关蛋白表达:western blotting验证细胞迁移蛋白表达情况,实验结果显示:DUSP5过表达组与对照组相比,MMP9、Vimentin的表达明显减少,E-cadherin表达明显增多;DUSP5干扰组与对照组相比,MMP9、Vimentin的表达明显增加,E-cadherin表达明显减少(图5.1)(P<0.05)。6.KEGG富集分析筛选关键信号通路:分别对GSE27155,GSE53157和GSE29315三个数据集的差异表达基因进行KEGG富集分析发现,MAPK信号通路在三个数据集中均富集显著(图6.1-6.3)。7.MAPK信号通路对FTC的影响:抑制剂分别抑制MAPK信号通路三个亚通路(ERK MAPK,JNK,p38 MAPK)(图7.1)。EdU验证对细胞增殖的情况(图7.2),Transwell验证对细胞迁移侵袭的情况(图7.3,图7.4),结果显示:抑制ERK MAPK和JNK信号通路能明显抑制FTC-133细胞的增殖、迁移与侵袭,而p38 MAPK信号通路无影响。8.验证DUSP5对MAPK信号通路的调控作用:过表达质粒与小干扰转染干预DUSP5的表达,以western blotting检测ERK MAPK、JNK、p38 MAPK信号通路的激活情况(图8.1),结果发现:DUSP5下调能够激活ERK MAPK以及JNK信号通路。9.DUSP5通过ERK MAPK/JNK信号通路影响FTC增殖、迁移与侵袭:下调DUSP5表达的基础上给予ERK MAPK和JNK信号通路的抑制剂,“挽救”实验通过EdU、Transwell发现抑制ERK MAPK和JNK信号通路能够减少DUSP5下调导致的细胞增殖、迁移与侵袭(图9.1-9.3)。研究结论1、根据数据库综合筛选以及病理组织验证发现DUSP5与FTC患者的生存期密切相关,提示DUSP5可能作为FTC的一个新的预后标志物;2、体外实验表明,过表达甲状腺滤泡癌细胞的DUSP5,可抑制细胞迁移增殖和侵袭,而抑制细胞内DUSP5的表达,可以促进细胞迁移增殖和侵袭,对FTC细胞的侵袭力发挥重要作用。3、ERK MAPK以及JNK信号通路在FTC恶性生物学行为中发挥重要作用。4、DUSP5的下调激活ERK MAPK以及JNK信号通路促进FTC细胞的增殖、迁移与侵袭。