对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对虾暴发性流行病的主要病原,严重危害对虾养殖业。病毒入侵宿主首先要和靶细胞上对应的特异性受体结合,然后在宿主细胞内大量增殖。深入了解WSSV的感染机制,找到编码受体蛋白的基因,无疑对病害的防治具有基础性意义。本实验把病毒粘附蛋白VAP1的基因进行改造后将其应用于酵母双杂交系统Ⅲ,以探索用于筛选与其相互作用的对虾基因的可行性。 VAP1是白斑综合症病毒(WSSV)囊膜上与宿主有结合活性的粘附蛋白之一,已证实它在酵母双杂交系统中作为诱饵蛋白时存在自激活活性。在其C-末端有一个大的跨膜疏水区,拟去除该跨膜疏水区,即把粘附蛋白VAP1的C-末端去除对应的34个氨基酸。在WSSV全基因组中,针对VAP1基因特定位点去除102个bp后,用Primer Premier软件设计了一对引物,并引入Nde Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点,PCR扩增后,酶切、纯化,并定向连接于载体pGBKT7,然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,提取转化菌的质粒后进行PCR以及双酶切鉴定,确定有重组子后进行测序,结果表明序列完全正确。提取重组质粒并分别转化AH109、Y187酵母感受态细胞,选择性培养基鉴定结果表明:表达的诱饵融合蛋白没有激活报告基因HIS3和ADE2,但激活了MEL1。可利用HIS3和ADE2这两种报告基因进行双杂交筛选。 用文库菌株AH109[cDNA Library]和含融合质粒的菌株Y187[pGBKT7-VAP1]做酵母融合,经TDO、QDO缺陷型培养基筛选,并反复划线培养于QDO缺陷型培养基并结合PCR技术确定了一个阳性克隆。对PCR扩增得到的cDNA片段进行测序,其长度为649bp。以+2阅读框分析其核苷酸序列,该序列从终止密码子(TAA)之前即为一个开放阅读框(ORF),这可能即为该段DNA所编码的蛋白。将该cDNA片段于NCBI中经BLASTP同源性比较分析,结果表明其表达的蛋白与一未命名蛋白产物(Unnamed protein product)的同源性最高为59%,与蛋白酶的同源性为38%,与Cell wall mannoprotein,acceptor of B1-6 glucan的同源性为26%。从病毒与鳃膜蛋白的特异性结合推测该蛋白很可能是一种蛋白酶,它与病毒粘附蛋白的结合类似于酶与底物的结合,具有高度的专一