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前言 亚甲蓝(Methylene Blue)简称MB，又名美蓝、甲烯蓝、次甲蓝，是噻嗪染料类化合物，为水溶性色素，具有一定的神经阻滞作用，其作用时间长，不像乙醇及酚类那样使蛋白凝固及引起细胞膜的改变。实验证明正常治疗的浓度药液仅有短期应激性改变，而无蛋白凝固及细胞膜的病理损害。但如果应用高浓度的MB或鞘内注射会造成不可逆的组织损害。但MB作为一种神经阻滞药，因其低浓度作神经周围注射的阻滞是可逆的，并不引起永久性的组织损害。MB还具有局部麻醉作用。MB为一种氧化还原剂，高浓度时直接使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，低浓度时在还原型辅酶Ⅰ脱氢酶(NADPH)的作用下，MB还原成为还原型MB，能将高铁还原型蛋白还原为血红蛋白，所以低浓度MB能治疗高铁血红蛋白症。 亚甲蓝已应用于多种肿瘤手术中，如膀胱癌、贲门癌胃癌、大肠癌、肺癌以及肝癌等。席兆华报导，胃癌病人行根治术时，用美蓝(亚甲蓝)行胃癌病灶及周围浸润，使胃周淋巴结染色后进行清除。其它如亚甲蓝进行大肠癌淋巴结染色检查，亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞的作用，证实其对人大肠癌细胞亦具有明显的体外杀伤和抑制作用。亚甲蓝对肿瘤细胞的亲和力及渗透力与正常细胞有所不同，可使肿瘤细胞蓝染，而正常粘膜上皮不被着色。 亚甲蓝无毒副作用，最高剂量可用至500mg，实验结果表明：亚甲蓝杀伤癌细胞作用有明显的浓度和时间依赖性。电镜检查细胞主要损伤部位为线粒体，其结构破坏、肿胀、断面呈空腔。亚甲蓝的抗癌机制有研究推测，与其作用为受氢体，降低NAD(P)H水平，干扰氧化还原平衡，从而导致癌细胞呼吸能量代谢障碍，或与药物直接干扰氧化还原系统，产生毒性物质有关。 细胞增殖是细胞生命的基本特征，与机体的生长、再生、修复、细胞程序性死亡及肿瘤发生密切相关。增殖细胞核抗原(PCNA)是一种细胞周期调节蛋白，其合成水平反应细胞增殖率，作为DNA多聚酶δ的辅助蛋白，是DNA复制合成必不可少的物质。PCNA可与多种物质相互作用，参与DNA的修补、甲基化以及染色质的装配，由于上述反应主要发生于DNA的复制过程中，因此PCNA可以作为DNA合成的标识物，并且是目前肿瘤增殖活动研究中可靠的增殖期标志物。 本研究采用大鼠c6脑胶质瘤细胞作为研究MB的工作模型，观察MB对C6细胞增殖抑制作用，证实MB对体外培养C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用，并探讨其作用机制。发现MB对体外培养c6胶质瘤细胞具有促凋亡作用。观察MB与化疗药物BCNU的协同抗肿瘤作用，证实MB的抗胶质瘤的作用，并为MB作为肿瘤辅助治疗提供理论和实验依据。实验材料与方法 1、实验试剂 RPMI一1640和小牛血清购自美国Gibco/BRL公司; 胰蛋白酶、MB、四氮哇(M竹)、兔抗人PCNA抗体购自美国Sigma公司; SABC及DAB试剂盒购自武汉博士德生物制品公司; Hoechst33258染色试剂盒购自江苏海门碧云天生物技术研究所; 抗兔Bax、Bcl一d抗体购自博士德生物工程有限公司; RNA提取试剂为美国Gibeo/BRL公司的T班201 reagent; PCRkit为上海生工产品; 反转录系统系日本宝生物(大连)公司的BcaBest kit; 2、实验材料 C6胶质瘤细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所;成年雄性Wistar大鼠，购自本校动物中心。 3、实验方法 采用四氮哇(M，I’r)比色法测定不同浓度MB(低剂量组0.04一0.08林扩血、中剂量组0 .10一0.14林群耐、高剂量组0.16一0.20林扩nd)作用24小时后，对C6细胞的增殖抑制作用。 (z)采用免疫组化法测定经MB作用前后c6细胞增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达情况并分析其意义。 (3)用荧光显微镜、透射电镜进行细胞凋亡形态观察;流式细胞术进行细胞周期解析。 (4)用RT一PCR、Westem一blot进行凋亡相关基因Bax、Bel一xl mRNA和蛋白表达检测。 (5)于Wistar大鼠左肩脚皮下注射C6细胞悬液，20天后肿瘤均生长至1.0一1.5。m。80只Wistax大鼠随机分为4组，每组20只:A一对照组;B-MB治疗组(MB:0.Zm扩扩d腹腔内注射);C一BCNU治疗组(BCNU:0.0025m岁扩d腹腔内注射);D一MB、BCNU联合治疗组。观察MB和BCNU对Wistal大鼠C6胶质瘤模型的治疗效果。实验结果 (l)MB对C6细胞的增殖有明显的浓度依赖性抑制作用;MB作用前后C6细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达有显著差异(P<0.01)。 (2)MB( 0.1林岁nil)作用24小时，荧光显微镜、透射电镜进行细胞凋亡形态观察发现细胞发生典型的凋亡形态改变;Bax mRNA随MB作用时间延长而升高，Bd一双mRNA随MB作用时间延长而下降，各组间均有显著差异(P<0.01);Bax蛋白随MB作用时间延长而升高，6h与 24h比较有显著差异(P<0.01)，6h与12h、12h与24h比较无显著差异(P>0.05);Bel一过蛋白随MB作用时间延长而下降，6h与12h、24h比较有显著差异(P<0.01)，12h与24h比较无显著差异(P>0.05)。 (3)MB治疗组与对照组比较，肿瘤体积缩小不明显(巧%);BCNU治疗组肿瘤体积缩小58%;联合用药组肿瘤体积缩小89%。第41天，BcNu治疗组与联合用药组肿瘤体