本课题研究包括二部分,分述如下:目的:第一部分检测MAPK4在内毒素诱导的小鼠急性肺损伤中的表达;观察MAPK4敲除对急性肺损伤的影响并探讨其相关机制。第二部分观察干扰MAPK4表达对内毒素诱导的小鼠急性肺损伤的影响。方法:第一部分1.利用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）按照10mg/kg的剂量对C57BL/6野生型小鼠（Wild type,WT）进行腹腔注射,构建小鼠急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）模型;Real-time PCR检测小鼠肺脏组织中MAPK4的mRNA水平;免疫印迹（Western blot,WB）检测小鼠肺脏组织中MAPK4的蛋白水平;免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测小鼠肺脏组织中MAPK4的表达及定位情况。2.利用LPS腹腔注射WT和MAPK4基因敲除(MAPK4^-/-)小鼠,分别构建ALI模型;观察记录两组小鼠的生存情况;24h后取小鼠肺脏组织,记录小鼠体重指数和肺脏脏器指数变化,并检测肺脏干湿重比;BCA法检测小鼠肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中总蛋白含量;HE染色观察小鼠肺脏组织病理学变化;Real-time PCR检测小鼠肺脏组织中IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子的mRNA水平,ELISA检测小鼠BALF中IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子的蛋白水平;流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测小鼠BALF中Gr-1⁺中性粒细胞、F4/80⁺巨噬细胞、NK1.1⁺细胞等免疫细胞的比例及其总数变化;Western blot和IHC检测小鼠肺脏组织中p-MK5、p-AKT、p-ERK1/2和p-JNK等信号通路分子的表达。3.取ALI模型小鼠肺脏组织,提取基因组DNA,利用质谱技术（SequenomMassARRAY）检测ALI模型前后MAPK4启动子区域中CpG岛的甲基化水平。4.利用3’端缺失实验,分别构建不同长度的MAPK4启动子载体,将构建好的载体分别瞬时转染到RAW264.7巨噬细胞中,检测荧光素酶活性,筛选出ALI中调控MAPK4表达的启动子核心区域;利用生物信息学数据库预测MAPK4启动子核心区域中候选的重要转录因子;Real-time PCR和Western blot技术检测ALI模型前后相关转录因子的mRNA水平和蛋白水平;EMSA实验验证转录因子与MAPK4启动子的结合。第二部分1.利用LPS腹腔注射WT小鼠,建立小鼠ALI模型,于模型建立后利用构建好的MAPK4-shRNA载体,通过滴鼻给药的方式,干扰MAPK4在小鼠肺脏中的表达;Real-time PCR和Western blot检测肺脏组织中MAPK4的mRNA水平和蛋白水平;HE染色观察小鼠肺脏组织的病理学变化。2.Real-time PCR检测上述各组模型小鼠肺脏组织中IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子的表达水平;Western blot检测小鼠肺脏组织中p-AKT、p-ERK1/2和p-JNK等信号通路分子的变化;最后,LPS大剂量攻击小鼠,观察记录小鼠生存情况。结果:第一部分1.Real-time PCR结果显示:ALI模型小鼠肺脏组织中MAPK4的mRNA水平明显增高,且在24h时达到最高点（P<0.05）;Western blot结果显示:ALI模型小鼠肺脏组织中MAPK4的蛋白水平明显上调（P<0.05）;IF结果显示:MAPK4在ALI模型小鼠肺脏组织中的表达明显增多,且MAPK4在巨噬细胞中存在表达。2.观察记录小鼠生存情况发现:相比WT小鼠,LPS腹腔注射后MAPK4^-/-小鼠有着明显延长的生存时间（P<0.05）;两组小鼠的体重指数和肺脏脏器指数无明显变化（P>0.05）;重要的是,相比WT小鼠,MAPK4^-/-小鼠的肺脏水肿率和BALF总蛋白含量明显减少;HE染色结果显示:相比WT小鼠,MAPK4^-/-小鼠肺脏组织中肺泡间质增厚和炎性细胞浸润明显减轻;Real-time PCR和ELISA结果显示:与对照组相比,MAPK4^-/-小鼠中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α在肺组织的表达明显降低（P<0.05）,而抑炎细胞因子IL-4、IL-10和TGF-β的表达明显升高（P<0.05）;FCM结果显示:与对照组相比,MAPK4^-/-小鼠BALF中浸润的细胞总数明显减少（P<0.05）;进一步分析发现:MAPK4^-/-小鼠BALF中Gr-1⁺中性粒细胞、γδT⁺细胞和CD11c⁺树突状细胞的细胞比例和总数明显减少（P<0.05）,NK1.1⁺细胞和F4/80⁺巨噬细胞的细胞比例无明显变化（P>0.05）,但细胞总数明显减少（P<0.05）;此外,MAPK4^-/-小鼠BALF中F4/80⁺巨噬细胞的表面分子MHC II⁺的比例有所增加（P<0.05）;CD4⁺T细胞的细胞比例和总数明显减少（P<0.05）,而CD8⁺T细胞的细胞比例有所增加（P<0.05）,但细胞总数无明显变化（P>0.05）;MAPK4^-/-小鼠BALF中CD4⁺T细胞的功能分子CD62L⁺和CD69⁺的细胞比例和总数明显减少（P<0.05）,CD8⁺T细胞的功能分子CD62L⁺的细胞比例有所增加（P<0.05）;Western blot和IHC检测结果显示:与对照组相比,MAPK4^-/-小鼠的肺组织中p-AKT、p-JNK、p-p38 MAPK和p-MK5的表达水平均明显减少（P<0.05）。3.生物信息学预测结果显示:MAPK4启动子区域内存在一个CpG岛,距离TSS+72⁺382位置;进一步利用质谱技术对这个CpG岛的甲基化水平进行检测发现:与对照组相比,ALI模型组肺脏组织中MAPK4启动子区域内的CpG岛中各个CpG位点的甲基化水平无明显变化（P>0.05）。4.3’端缺失实验结果显示:MAPK4启动子序列从2.2kb截断到1.5kb后,荧光素酶活性明显增强（P<0.05）,提示2.2kb到1.5kb这段区域（距离TSS-470⁺173）为调控MAPK4表达的启动子核心区域;生物信息学数据库TRANSFAC和JASPAP预测出该区域中5个可能参与调控MAPK4表达的转录因子,分别是Sp1、Egr-1、PU.1、NR3C1、NFKB1;Real-time PCR结果显示:与对照小鼠相比,ALI模型小鼠肺脏组织中PU.1和Sp1的mRNA表达水平明显增多（P<0.05）,NR3C1、Egr-1和NFKB1的mRNA表达水平明显减少（P<0.05）,提示NR3C1和NFKB1可能是调控ALI模型中MAPK4表达的两个重要转录因子;Western blot检测结果显示:与对照组小鼠相比,NR3C1和NFKB1的蛋白水平在ALI模型小鼠的肺脏组织中明显低表达（P<0.05）;最后,EMSA实验结果显示:NR3C1和NFKB1可以与MAPK4的启动子核心序列结合。第二部分1.Real-time PCR和Western blot结果显示:MAPK4-shRNA处理能够明显下调MAPK4在小鼠肺脏组织中的表达（P<0.05）;分析肺脏干湿重比发现:肺脏水肿率在MAPK4-shRNA处理组明显降低（P<0.05）;HE染色结果显示:肺脏炎症在MAPK4-shRNA处理组明显减轻。2.Real-time PCR检测结果显示:与对照组相比,MAPK4-shRNA处理组中促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达明显降低（P<0.05）,而抑炎细胞因子IL-10的表达明显增高（P<0.05）;Western blot检测结果显示:p-AKT、p-JNK和p-p38MAPK在MAPK4-shRNA处理组低表达;最后,使用LPS大剂量攻击小鼠发现:相比对照组小鼠,MAPK4-shRNA处理组小鼠有着明显延长的生存时间（P<0.05）。结论:1.MAPK4在ALI模型小鼠肺脏组织中高表达;MAPK4敲除可以显著性减轻ALI模型小鼠的病理变化,伴随AKT等相关信号通路传递的改变。2.ALI中MAPK4的表达可能与其启动子DNA甲基化无相关性,主要受转录因子NFKB1和NR3C1负性调控。3.MAPK4体内干扰能够有效减轻ALI模型小鼠的病理变化,并延长其生存时间。