研究背景:恶性胶质瘤有较高的复发率和死亡率。尽管治疗手段不断增加,但多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)病人的平均生存时间仍旧只有12-14个月。GBM内高表达多种促血管生成因子且有大量异常增生血管。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在GBM新生血管形成过程中起重要作用。VEGF能够和血管内皮细胞表面的受体VEGFR-1和VEGFR-2结合,具有促进内皮细胞的分裂、生长的作用。VEGF与血管内皮细胞的受体结合,还能促进多种溶解酶产生,促进细胞外基质降解从而增大血管通透性。抗肿瘤血管生成一直是胶质瘤治疗研究的重点。贝伐单抗是一种人源性的单克隆抗体,是目前最常用的抗血管生成靶向药物。于2009年获得FDA批准,是目前唯一批准在临床应用的抗肿瘤血管药物。主要用于治疗复发性GBM。在有些地区,贝伐单抗已被批准作为GBM治疗的一线药物,用于单独治疗或者结合放疗和替莫唑胺治疗新诊断的GBM。但是,贝伐单抗能够降低胶质瘤血管的通透性,促进“血管正常化”,而血管通透性的下降限制了后续贝伐单抗或其它药物向肿瘤区域的渗透,从而影响了抗肿瘤药物的治疗效果。血-脑屏障的存在限制了药物在中枢神经系统疾病中的应用。研究表明接近100%的大分子和98%的大分子药物不能够通过血-脑屏障。胶质瘤血管具有很高的通透性,因而常伴随着瘤周水肿和肿瘤内部间质压力的增高,这些都限制了治疗药物向肿瘤内部的渗透。另外,尽管肿瘤内部血-脑屏障被破坏,血管通透性增加,但是肿瘤的某些滋养血管仍然保留有血-脑屏障的特征,从而形成了血-脑肿瘤屏障。该屏障和血-脑屏障类似,位于肿瘤细胞和由特异性内皮细胞组成的肿瘤血管之间。尽管血-脑肿瘤屏障的通透性高于血-脑屏障,但是该屏障的存在仍然限制了药物在肿瘤治疗中的应用。因此,寻找一种促进药物跨过血脑-肿瘤屏障的方法对胶质瘤的治疗至关重要。空化效应是超声波主要生物学效应之一。超声空化效应可以用于毁损血管,溶解血栓,提高心肌的通透性以及药物的释放和基因的转染等。微泡是一种有效的超声空化核,能够降低超声空化的阈值。近年来有研究采用聚焦超声联合微泡造影剂开放了血-脑肿瘤屏障,促进了药物和基因向肿瘤的靶向传送。但是,原发性的恶性胶质瘤常向周围脑组织侵润性生长,并在肿瘤远处形成多发的卫星灶。聚焦超声虽然能够聚焦在瘤体发挥作用,但却不能作用到瘤体周围的卫星灶。因此,在本研究中,我们尝试采用低频的诊断超声联合微泡造影剂开放血-脑肿瘤屏障,增强贝伐单抗向脑胶质瘤的递送效率,进而增加药物的治疗效果。研究目的:1.探讨微泡增强的诊断超声增加胶质瘤血-脑肿瘤屏障通透性的可行性、安全性及相关机制;2.探讨微泡增强的诊断超声增强贝伐单抗治疗脑胶质瘤效果的可行性;3.探讨贝伐单抗治疗后脑胶质瘤MRI变化及相对应的病理机制。材料和方法:1.微泡增强的诊断超声增加大鼠血-脑肿瘤屏障通透性的可行性及相关机制研究荷瘤大鼠随机分成三组:微泡增强的连续诊断超声组(MECUS)、微泡增强的间歇诊断超声组(MEIUS)和对照组。每组实验动物在经尾静脉注入微泡的同时,给予诊断超声经颅骨辐照。然后利用依文思蓝(EB)的渗出量及动态增强磁共振(DCE-MRI)评估血-脑肿瘤屏障通透性变化情况。利用定量PCR(q RT-PCR)、蛋白质免疫印记(WB)及免疫组化检测处理后紧密连接粘附分子-A(JAM-A)和钙激活的钾通道(KCa)的表达情况。利用光镜HE和TUNEL法检测处理后肿瘤周围正常脑组织是否损伤。2.微泡增强的诊断超声增强贝伐单抗治疗胶质瘤效果的实验研究荷瘤小鼠随机分成四组:微泡增强的超声空化联合贝伐单抗组(MEUS+BEV)、贝伐单抗组(BEV)、微泡增强的超声空化组(MEUS)和对照组。每组实验动物经不同处理后利用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测瘤体内贝伐单抗的浓度,处理后3天利用CD34染色测量肿瘤区域微血管密度(MVD)的变化。贝伐单抗干预后,利用7.0T小动物MRI检测处理前后肿瘤体积、表面扩散系数(ADC)、T1增强以及动态增强磁共振(DCE-MRI)的变化情况。利用免疫组织化学染色观察处理前后肿瘤内Ki67阳性细胞数、紧密连接蛋白claudin-5和occludin以及血管生成模式(套叠)的变化。利用透射电镜观察处理前后肿瘤内部紧密连接的变化。并对转移常数Ktrans和血管套叠、T1增强和紧密连接蛋白以及ADC和Ki67阳性细胞进行相关性分析。结果:1.微泡增强的诊断超声增加大鼠胶质瘤血-脑肿瘤屏障通透性的可行性及相关机制研究EB定量分析显示在MEIUS组和MECUS组,EB的渗出量分别为17.9±2.3μg/g和11.0±2.2μg/g,明显高于对照组的5.3±0.9μg/g。MEIUS组的EB渗出量明显高于MECUS组。DCE-MRI结果显示MEIUS组和MECUS组的Ktrans值明显高于对照组,且肿瘤区域的EB渗出量和Ktrans值呈明显的正相关。q RT-PCR、WB及免疫组化结果显示MEUS能够增加肿瘤区域KCa通道的表达并下调JAM-A的表达,这种效应MEIUS组比MECUS组更明显。HE和TUNEL结果显示处理后各组肿瘤周围的正常脑组织未见明显异常改变。2.微泡增强的诊断超声增强贝伐单抗治疗效果的实验研究ELISA结果显示MEUS+BEV组瘤体内贝伐单抗的浓度为88.8±18μg/g,明显高于BEV组的42.2±15μg/g。而处理后3天MEUS+BEV组肿瘤区域的MVD为10.8±1.8,明显低于BEV组的18.2±1.6。MRI结果显示,贝伐单抗能够降低U87胶质瘤的生长速率并抑制肿瘤细胞的增殖。肿瘤区域的ADC值和Ki67阳性细胞数呈明显的负相关。贝伐单抗干预后,T1增强程度和Ktrans值明显下降;透射电镜和免疫组化结果均显示肿瘤区域的紧密连接部分恢复。另外,贝伐单抗导致了肿瘤内部血管套叠数量增加。而肿瘤区域Ktrans值和血管套叠数量呈明显的负相关。T1增强值和紧密连接蛋白的表达呈明显的负相关。结论:1.微泡增强的诊断超声能够安全、有效的增加大鼠血-脑肿瘤屏障的通透性。涉及到机制可能包括下调肿瘤区域JAM-A的表达进而影响紧密连接的形成和上调KCa通道的表达进而促进细胞的胞吞作用。另外,Ktrans可以做为预测胶质瘤血-脑肿瘤屏障通透性的磁共振标记。2.微泡增强的诊断超声能够有效地增加U87原位胶质瘤模型局部贝伐单抗的浓度,并且能够增强贝伐单抗抑制肿瘤区域血管生成的治疗效果。贝伐单抗有效降低了U87胶质瘤的生长速率并抑制肿瘤细胞的增殖。贝伐单抗能使肿瘤区域血-脑肿瘤屏障通透性下降,涉及到的机制可能包括血-脑屏障紧密连接的部分恢复和肿瘤内部血管生成模式的改变。另外,ADC、Ktrans值和T1增强可以做为预测U87胶质瘤内细胞增殖、血管生成模式变化和紧密连接变化的磁共振标记。