论文部分内容阅读
心律失常，尤其是严重的室性心律失常，是致心血管病患者死亡的主要原因之一。揭示心律失常发生的细胞分子机制，对于心血管疾病治疗有重要意义。先天遗传基因改变或后天获得性因素引起心肌离子通道的结构和/或功能紊乱是产生心律失常的重要分子基础[1-5]。其中获得性离子通道功能的改变与神经体液系统的过度激活（特别是交感肾上腺素和肾素-血管紧张素-醛固酮系统）密切相关。已有大量文献报道，肾上腺素α1A受体和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) AT1受体可调节心肌细胞膜上的离子通道功能，是心血管疾病病理情况下通道功能异常的重要原因[6-10]。 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)作为细胞功能调控的重要分子，中介多种神经体液因子作用，在离子通道功能调节中发挥重要作用[11-19]。依据PKC结构与激活机制分为三类:传统型PKC（cPKC，包括α、βⅠ、βⅡ和γ），新型PKC（nPKC，包括δ、ε、π和θ），非典型PKC（aPKC，包括ζ、ι/λ）。已知不同动物种属的心肌组织均存在PKCα、βⅠ、βⅡ、γ、ε、θ、δ等亚型，尤其富含PKCα和PKCε亚型[20-22]。有研究表明，对通道动力学不同的调控方式提示可能不同的PKC亚型中介两种G蛋白偶联受体的作用[23-30]，肾上腺素α1A受体和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) AT1受体激动均可通过PKC信号通路调控心脏HERG钾通道功能[24,31-33]。 因此，本研究主要用分子生物学方法，在稳定表达HERG钾通道的HERG-HEK293细胞，以及成年豚鼠心脏，分给予A61603（α1A受体激动剂）、AngⅡ(AT1受体激动剂)，测定受体激动后不同亚型磷酸化PKC含量变化（PKC自身的磷酸化为其活化的表现），确定PKC激动的亚型特异性。利用免疫共沉淀(CoIP)方法进一步分析激活的PKCε、PKCα与HERG钾通道的空间关系，为两种G蛋白偶联受体通过不同亚型PKC调节HERG钾通道功能提供分子生物学实验基础。 目的: 利用特异性磷酸化PKC抗体检测α1A和AT1受体激动后不同PKC亚型的活化以及其与HERG钾通道的关系 方法: 在稳定表达HERG钾通道cDNA的HERG-HEK293细胞上瞬转α1A或AT1受体后，分别加入A61603或AngⅡ10分钟后，提细胞膜蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后将蛋白转移至PVDF膜上，5％BSA封闭液封闭2小时后，依次加入特异性p-PKCα（磷酸化PKCα抗体），p-PKCε（磷酸化PKCε抗体）和GAPDH（内参蛋白）一抗过夜后，洗膜孵荧光二抗，用Odyssey9120双色红外激光成像系统仪器扫描，分析蛋白条带，检测目的蛋白表达的变化。目的蛋白的相对含量以目的蛋白与其GAPDH的灰度值比值表示，并均以对照组的灰度比值1，计算出给药后目的蛋白表达量的变化。用OriginPro7.5进行数据分析，采用平均数±标准误表示，实验重复次数用n表示。采用t检验进行组间数据比较，当P＜0.05时，认为组间的差异有统计学意义。 使用豚鼠左心室心肌组织重复以上实验。完整豚鼠心脏快速取出后，置Langendorff灌流装置，台氏液灌流待稳定后，灌流A61603或AngⅡ10,分钟，提取左心室组织膜蛋白做Western Blot，检测磷酸化PKCα和PKCε含量，数据处理同上。为验证磷酸化PKCα和PKCε与HERG钾通道的关系，做免疫共沉淀(CoIP)实验。依次完成裂解，沉淀，预清除，抗体混悬过夜，加琼脂糖珠，洗脱等步骤，将所得蛋白液进行Western Blot实验，检测HERG钾通道蛋白，p-PKCα和p-PKCε。 结果: 1、α1A和AT1受体激动后，不同PKC亚型的活化 Western blot结果显示，在稳态表达HERG-HEK293细胞，α1受体激动剂A61603(1μM)处理细胞明显提高p-PKCα表达量，约为control组的1.2倍(P＜0.05，n=3)，p-PKCα含量变化与PKC激动剂PMA相近，然而，A61603并不影响p-PKCε的含量;豚鼠心脏灌流A61603后，p-PKCα蛋白含量为control组的1.1(P＜0.05，n=3)倍;p-PKCε含量虽有变化，但无统计学意义。以上实验表明，α1A受体激动剂可选择性激活PKCα亚型。 HERG-HEK293细胞瞬转AT1受体，加入AngⅡ(100nM)孵育后，Western blot结果显示p-PKCα含量约为control组的1.2倍(P＜0.05，n=3)，p-PKCε蛋白含量约为control组的1.2倍，表达变化与PMA相近;豚鼠心脏灌流AngⅡ后，左心室组织膜蛋白p-PKCα蛋白含量约为control组的1.2倍(P＜0.05，n=3)，p-PKCε蛋白含量为control组的1.3倍(P＜0.05，n=3)，AngⅡ对p-PKCα，p-PKCε蛋白表达的变化均与PMA相似。以上实验表明，AT1受体激动剂可以选择性的激动PKCα和PKCε，且对PKCε的激动作用更强。 2、激活的PKCα和PKCε与hERG钾通道的相互关系。 豚鼠心脏灌流A61603或AngⅡ后，左心室组织做CoIP实验验证蛋白-蛋白相互作用。实验结果显示，用特异性抗体免疫沉淀HERG蛋白后，Western blot显示p-PKCα和p-PKCε蛋白条带均呈阳性;提示p-PKCα、p-PKCε与HERG通道共定位在细胞膜上。 结论: 1、α1A受体激动剂可以选择性的激动PKCα;而对PKCε，α1A受体激动剂未见明显作用;AT1受体激动剂可以同时激动PKCα与PKCε，但激动程度有一定差异，在豚鼠心室组织对PKCε作用更强。 2、免疫共沉淀实验提示，p-PKCα和p-PKCε与HERG通道蛋白存在共定位现象，提示激活的PKCα和PKC可能直接调控通道功能。