目的:通过体外实验,研究新藤黄酸（GNA）对顺铂耐药非小细胞肺癌（NSCLC）细胞A549/Cis细胞周期、凋亡及顺铂耐药的影响。采用高通量测序（RNA-seq）方法研究GNA影响的A549/Cis细胞转录调控,分析差异基因表达及其功能,探讨GNA引起的A549/C is细胞生物学效应的重要线索,并加以验证。最后,通过在A549/C is细胞中分别过表达MTCYB和沉默TP53来研究二者在GNA介导的生长抑制中的作用,以阐明GNA影响A549/Cis细胞顺铂耐药的潜在调控靶点,为其在治疗顺铂耐药非小细胞肺癌的临床应用提供理论依据。材料与方法:论文一:MTT法验证A549/Cis细胞对顺铂的耐药性。使用不同浓度的顺铂处理A549细胞和A549/Cis细胞,分别于24h、48h、72h后加入MTT（5mg/ml）20μl,37°C孵育4h后,弃上清并加入DMSO溶解甲瓒,然后测定OD值,记录实验结果。MTT法检测GNA对A549细胞、A549/C is细胞生长的抑制作用。Hoechst 33342染色和荧光显微观察检测GNA对A549/Cis细胞形态的影响。GNA分别处理A549/Cis 24h,48h后,用Hoechst 33342（10μg/ml）染色,37?C孵育20min,并通过荧光显微镜观察细胞形态变化。流式细胞术检测GNA对A549/Cis细胞周期分布和凋亡的影响。细胞洗涤并经-20?C预冷的70%酒精固定过夜,用核糖核酸酶（RNase）溶液消化后经碘化丙啶（PI）染色,然后使用流式细胞仪进行细胞周期分析。根据Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒使用说明对细胞进行染色,并用流式细胞仪检测染色细胞的凋亡率,数据通过Flowjo7.6.1软件进行分析。论文二:GNA处理前后A549/Cis细胞转录组学研究。A549/Cis细胞经4μM GNA处理24 h后,用TRIzol法提取总RNA。RNA-seq通过Illumina X10测序平台进行测序。使用Stringtie来分析m RNA的表达水平。使用R package-Ballgown选择|log2 fold change|≥1且具有统计学意义（P<0.05）的差异表达的m RNA和基因。通过DAVID网站（http://david.ncifcrf.gov/）进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。实时荧光定量PCR验证差异基因表达。根据Gene JET RNA纯化试剂盒使用说明提取A549/C is细胞总RNA。使用First Strand c DNA合成试剂盒进行c DNA合成,然后使用SYBR?Select Master Mix Kit试剂盒和实时PCR仪进行q PCR。通过比较性2^-ΔΔCT法进行定量分析。Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。根据核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒使用说明提取核蛋白。BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行显色。使用Image J version 1.52软件对蛋白表达水平进行定量分析。论文三:构建MTCYB基因过表达逆转录病毒载体MSCV-PGK-MTCYB-2a-zs Green,转染293T细胞。用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选zs Green表达阳性（绿色荧光）的细胞,并用激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。q RT-PCR实验对分选后细胞的MTCYB的m RNA表达进行检测。最后通过MTT法检测过表达MTC YB的细胞对GNA敏感性的变化。构建人TP53基因RNA干扰（RNAi）逆转录病毒载体MSCV-U6-p53sh RNA-EF1-BFP并转染293T细胞,用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选BFP表达阳性（蓝色荧光）的细胞,并通过激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。下一步通过Western blot法对分选后的细胞进行p53蛋白表达的测定,鉴定p53沉默效果。最后,采用MTT法检测p53干扰后细胞对GNA的敏感性的变化。结果:论文一1.GNA抑制A549、A549/Cis细胞生长,并诱导A549/C is细胞发生凋亡形态学变化。MTT实验结果显示A549/C is细胞对顺铂的耐药性明显高于亲本细胞（P<0.001）。GNA对A549和A549/C is细胞的抑制效应通过MTT实验被测定,与未处理组相比,GNA显著降低了A549和A549/C is细胞的存活率（P<0.001）。6μM浓度的GNA仅在24h后即能诱导大量的细胞死亡,因此在随后的实验中使用了2μM和4μM浓度的GNA。Hoechst 33342染色实验进一步证明了GNA对A549/C is细胞的抑制作用。与未处理的细胞相比,经GNA处理的A549/Cis细胞增殖受到抑制,并出现明显的形态学改变。此外,在GNA处理的细胞中可观察到核固缩现象。2.GNA诱导A549/Cis细胞周期G1期阻滞和凋亡。为了研究GNA抑制A549/Cis增殖的细胞进程,我们使用流式细胞仪检测了A549/C is的细胞周期和凋亡情况。结果表明,与未处理组相比,GN A处理A549/C is细胞24h和48h后,细胞周期明显被阻滞于G1期（P<0.05）。4μM GNA作用48h后,sub-G1期亚群细胞数明显高于未处理组（P<0.001）。细胞周期阻滞可以诱导细胞死亡,并可通过流式细胞仪进行检测。Annexin V-APC/7-AAD双染色实验结果显示,4μM GNA作用于A549/Cis细胞48h后,凋亡率明显高于对照组（P<0.001）。论文二1.经GNA处理A549/Cis细胞差异基因表达和富集分析结果。为了探究GNA如何抑制A549/Cis细胞的生长和促进其死亡,我们使用对照细胞和经GNA处理的细胞进行了RN A-seq实验。数据分析表明,GNA的处理引发了全局基因表达的变化。我们以P<0.05且|log2 fold change|≥1为筛选条件对以上基因进行了进一步的筛选,满足以上条件的基因视为差异表达基因（DEGs）。与对照组细胞相比,在GNA处理的细胞中,有353个上调的DEGs和425个下调的DEGs。为了进一步研究DEGs的功能,我们进行了GO功能和KEGG信号通路富集分析。经鉴定,在GO富集分析中,蛋白结合（protein binding）、胞质溶胶（cytosol）、细胞周期（cell cycle）是显著富集的类型。KEGG信号通路富集分析中,有26条显著富集（P<0.05）的信号通路。将上述K EGG信号通路按差异显著性排序后,发现DEGs主要富集于内质网蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、蛋白酶体（proteasome）、细胞周期（cell cycle）、Epstein-Barr病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、DNA复制（DNA replication）。其中细胞周期、DNA复制和p53信号通路与肿瘤增殖密切相关。2.q RT-PCR验证RNA-seq结果。为了验证RNA-seq结果,我们选取14个DEGs进行q RT-PCR分析。结果显示,与未处理组细胞相比,4μM GNA组细胞所有基因的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。在这些基因中,有4个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达上调,另外10个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达下调。共有10个基因[GADD45A、细胞周期蛋白D3（CCND3）、细胞周期蛋白B1（CCNB1）、CDC20、CDC25B、PCNA、PLK1、MCM2、MCM3和MCM 7]参与细胞周期调控,6个基因[GADD45A、CCND3、CCNB1、SERPIN E1、THBS1和TNFRSF10B]与p53信号通路相关,两个基因（CASPASE7和TNFRSF10B）与细胞凋亡相关。q RT-PCR的结果与RNA-seq分析结果一致。3.GNA处理的A549/Cis细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。为了进一步研究GNA诱导的细胞周期阻滞和凋亡的潜在作用机制,我们检测了与细胞周期检测点和凋亡相关的蛋白表达水平。结果表明,与未处理组相比,经GNA处理的A549/C is细胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4和CDK6的蛋白表达水平显著下调（P<0.05）,而p21、GADD45A、p53和核p53的蛋白表达显著上调（P<0.05）。此外,我们检测了GNA处理的细胞中凋亡调控蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,GNA能显著提高caspase3/7蛋白前体及其活性形式的表达水平（P<0.05）,其下游与DNA修复相关的凋亡标志性蛋白PARP在A549/Cis细胞中显著上调（P<0.05）,其裂解作用也明显增强（P<0.05）。论文三1.在A549/Cis细胞中过表达MTCYB融合基因后,其对GNA的敏感性未发生明显变化。本实验设计合成的MTCYB融合基因成功连接入双酶切线性化的表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和MTCYB过表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/Cis细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/Cis细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。流式细胞仪分选zs Green阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。q RT-PCR实验验证MTCYB的m RNA表达,与对照组和MSCV-PGK-Neo-2a-zs Green载体转染（A549/Cis-NC）组相比,A549/Cis-MTCYB组细胞MTCYB表达升高（P<0.05）。使用MTT法测定MTCYB基因过表达后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。GNA对三组细胞都有明显的抑制作用,但抑制作用无明显差异。2.在A549/Cis细胞中沉默p53后,细胞对GNA的敏感性降低。本实验设计合成的p53干扰片段成功连接入双酶切线性化的逆转录病毒表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和p53 sh RNA表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/C is细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/C is细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。随后流式细胞仪分选BFP阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。Western blot实验检测p53蛋白的表达,结果显示,与阴性对照组和MSCV-U6-EF1-BFP载体转染（A549/Cis-sh RNA-NC）组相比,A549/Cis-p53sh RNA1、2、3三组细胞p53蛋白水平均显著降低（P<0.05）,尤其A549/C is-p53sh RNA2组降低最显著（P<0.001）。MTT法测定p53沉默后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。与对照细胞和A549/Cis-sh RNA-NC细胞相比,A549/Cis-p53-sh RNA2细胞活力受到的抑制作用明显减弱（P<0.05）,对GNA敏感性降低。结论:1.GNA可通过介导细胞周期G1期阻滞并诱导细胞凋亡,从而抑制顺铂耐药非小细胞肺癌A549/Cis细胞的生长。2.转录组学研究表明GNA可显著下调A549/C is细胞中MTCYB基因的表达,且GNA通过调控p53/p21/cyclin D-CDK4/6介导A549/Cis细胞周期G1期阻滞,并通过激活caspase3/7诱导细胞凋亡。3.p53是GNA抑制A549/Cis细胞生长机制中的关键调控因子。