研究背景:机械通气具有生命支持的作用,但它也能导致严重的肺损伤。“生物伤”是其一个重要的发生机制,炎症和天然免疫反应在其中具有重要的作用。呼吸机相关性肺损伤(VALI)的生物标记物具有早期诊断和判断疾病预后的重要作用,并为探索VALI的发生机制提供新的切入点。目前文献报道的与VALI相关的生物标记物几乎是参与炎症和免疫网络调控中的关键分子,但是它们在VALI中的确切作用还未明确。并且目前还缺乏特异性和敏感性强,利于早期诊断和治疗的生物标记物。寻找新的、特异性和敏感性强的生物标记物是目前研究的重点。中性粒细胞(PMN)在VALI的发生过程中具有重要的作用,几乎参与了整个VALI的发生发展过程,在持续性肺损伤的正反馈环中处于中心地位。因此PMN或是其调节通路中的关键分子可以作为VALI生物标记物的重点候选分子。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)主要由中性粒细胞分泌,也能由肺泡上皮细胞分泌,它在体内如何调节上皮细胞的功能还不清楚,它是否参与VALI的发病过程文献报道鲜见。NGAL能反映PMN激活状态并广泛参与了炎症和免疫反应;它还是一种急性期反应蛋白和分泌蛋白,易于在血清和肺泡灌洗液中检测到。因此,鉴于上述NGAL具有作为生物标记物的这些生物学特性,我们设想NGAL可作为VALI生物标记物的深入研究的重要靶标,它可能作为机械力和炎症刺激的感受器参与了VALI的发病机制。目的:采用不同的机械通气策略作用于小鼠的健康肺和已有损伤的肺,构建不同的急性肺损伤模型。观察NGAL在小鼠VILI模型中不同机械通气策略对其表达的影响,希望能证实NGAL是VALI新的生物标记物的设想,为识别VALI高危病人提供有力工具。研究内容和方法:第一部分:分别以低吸气末峰压(PIP=15cmH2O2, PEEP=0 cmH2O2)、高吸气末峰压(PIP=50cmH2O, PEEP=2.5 cmH2O)、大潮气量(Vt=30ml/kg, PEEP=0cmH2O)和小潮气量(Vt=6ml/kg,PEEP=5cmH2O)给与健康雄性C57BL/6小鼠通气2h,利用半定量RT-PCR、实时定量RT-PCR的方法观察小鼠肺组织NGAL、MMP-9和IL-1βmRNA的变化;利用Western blot的方法检测NGAL蛋白在肺组织、血清和BAL中的变化;利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清和BAL中MMP-9和IL-1β蛋白水平的变化,观察不同通气策略对NGAL、MMP-9和IL-1βmRNA和蛋白表达的影响。并采用免疫组化的方法检测NGAL蛋白在损伤性通气肺组织中的空间定位。第二部分:分别以大潮气量(Vt=30ml/kg,PEEP=0cmH2O)和小潮气量(Vt=6ml/kg,PEEP=5cmH2O)给与健康小鼠通气2h和4h,观察不同通气时相对NGAL、MMP-9和IL-1βmRNA和蛋白表达的变化(检测方法同上)。第三部分:小鼠气管内分别滴入2.5mg/kg和5.0 mg/kg LPS,24h后以大潮气量(Vt=30ml/kg,PEEP=0cmH2O)和小潮气量(Vt=6ml/kg,PEEP=5cmH2O)给与通气2h,观察不同通气策略对LPS预处理小鼠肺组织NGAL、MMP-9和IL-1βmRNA和蛋白表达的影响(检测方法同上)。结果:第一部分:不同的通气策略都能引起小鼠NGAL的表达升高,在损伤性通气策略组升高显著,高吸气末峰压组和大潮气量通气组NGAL mRNA比对照组分别升高了41.9和3.29倍,BAL中NGAL蛋白水平上升了4倍和1.8倍,血清和肺组织中蛋白也有不同程度的上升。并且在肺组织的上皮细胞、血管内皮细胞和浸润的中性粒细胞表达,提示NGAL是对机械刺激敏感的传感蛋白,它可能参与了VILI的发病机制。MMP-9和IL-1β在大潮气量通气组的表达也明显上升,与NGAL的表达变化趋势相同。第二部分:在大潮气量组,随着通气时间的延长,NGAL在2h表达量较0h增加了3.29倍,在4h即迅速增加到8.75倍,蛋白的表达量也与损伤性通气时间成正相关。而在小潮气量组,NGAL的表达没有随通气时间的延长发生变化,维持在较低的水平,提示NGAL是监测VALI发生的有力指标。第三部分:小鼠单独气管内滴注LPS后能引起NGAL的表达升高。给与LPS预处理小鼠小潮气量通气后,NGAL的表达显著上升,明显高于单独LPS处理和单独机械通气组,mRNA增加了119.45倍,蛋白升高了6.1倍。MMP-9和IL-1β在BAL和血清中的水平也显著增高,提示LPS和机械通气具有协同刺激NGAL表达和释放的作用,非损伤性机械通气策略联合LPS就能导致肺损伤的形成。结论:1.不同的通气策略都能引起小鼠NGAL的表达升高,在损伤性通气策略中升高更明显。2.在大潮气量通气策略下NGAL的表达与损伤性通气时间成正相关。3.LPS也能上调NGAL的表达,LPS和机械通气具有刺激NGAL表达和释放的协同作用。4.NGAL可以作为早期判断VALI潜在的,新的生物标记物,监测血清和BAL中的NGAL水平是诊断VALI高危病人的有效工具。