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捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是寄生于牛、羊等反刍动物真胃内消化道寄生虫,以血液为食,给畜牧业造成极大的经济损失。“滞育”是虫体抵抗外界环境压力的有效措施,也是捻转血矛线虫病呈“春季高潮”的主要原因。因此对滞育现象的研究对于该病的防控具有重要的指导意义。本研究根据Gibbz(1971)的方法获得H. contortus ZJ株滞育虫体；采用RACE、Genome walking技术获得了滞育相关基因Hc-fau完成cDNA和全基因序列；在模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中通过显微注射、RNA干扰技术研究该基因在虫体内的对发育的调节作用；通过脂质体转染在HEK293细胞系中研究该基因各功能域之间的关系及功能；运用SwissModel对Hc-FAU进行同源建模。研究成果将为进一步阐述H. contortus滞育机制奠定基础。1.捻转血矛线虫ZJ株滞育虫体的获得及其形态特征本实验参照Adams(1986)的方法,通过瘤胃灌注,将捻转血矛线虫感染性三期幼虫攻入绵羊体内,对绵羊进行处理后,获得捻转血矛线虫滞育虫体。滞育虫体发育程度一致,虫体长1067±97 μm(n=18),肠道细胞中含有大量棒状结晶块；性腺开始发育,出现雌驱器原基；颈部出现颈乳突。通过温度检测分析,温度可能不是滞育现象的主要刺激因素。棒状结晶块可以被DAPI特异性着色,其成分可能含有核酸。2. Hc-fau基因的获得及其时空特异性研究在研究滞育机制的过程中,我们运用RNA差异显示技术研究正常虫体与滞育虫体各基因mRNA转录水平差异,获得了一个新基因Hc-fau,其在C. elegans和哺乳动物中的同源基因分别是Ce-rps30和fau。通过RNA可变剪辑,Hc-fau可编码两种蛋白Hc-FAUA和Hc-FAUB,分别由130和107个氨基酸组成。它们均含有类泛素蛋白(UBiL)结构域和核糖体蛋白S30结构域。在iL3中,呈广泛性表达；在滞育虫体中mRNA水平显著降低。3. Hc-FAU在秀丽隐杆线虫发育过程中的调节作用以C. elegans为模式生物,通过显微注射和RNAi技术在C. elegans中对Ce-rps30进行过表达和基因沉默,通过检测虫体寿命、体长、产卵量和肠道中脂肪沉积情况来确定Hc-FAU调节虫体发育的功能。结果表明,当过表达Hc-faua及过表达Ce-rps30时,虫体特征没有显著差别,但虫体寿命缩短,不能够正常发育产卵；过表达Hc-faua-ubil和Hc-faub-ubil时,虫体可以正常发育至成虫,虫体可以产卵,但产卵量显著降低；过表达Hc-fau-s30时,虫体体细胞不能正常发育,但性腺可发育至成熟,且可以产卵,但不能够排出体外而形成死胎；过表达Hc-faub时虫体F2代虫卵不能够孵化。在C. elegans中对Ce-rps30进行基因沉默后,虫体寿命延长,但发育速度显著减慢,且不能发育至成虫,不能产卵,体内脂肪储存增加。通过表型分析,UBiL与S30结构域对于体细胞和性腺细胞的调节具有协同作用；且UBiL主要调节性腺细胞的发育,而S30结构域主要调节体细胞的发育。为了进一步探寻C. elegans RNAi虫体中可能与Ce-rps30有关系的基因,我们分别检测了IIS, TGF-β, cGMP, dafachronic acid (DA),细胞凋亡(AP)和脂肪酸代谢(FA)相关基因中mRNA水平。结果显示除了daf-16和akt-1显著升高外,其它基因均显著降低。而daf-16的下游基因也显著降低,且虫体抗热应激能力没有显著增加,因此,在C. elegansRNAi虫体中AKT-1对DAF-16的磷酸化作用起到较强的作用,可能DAF-16高表达起到了其他的作用。4. Hc-FAU天然融合蛋白现象的初步研究Hc-FAU是天然融合蛋白,由UBiL和S30融合表达后被裂解成两个蛋白。为了研究这种天然融合蛋白现象,本研究在HEK293细胞系中表达Hc-fau,通过表达时间及对HEK293细胞系进行处理,观察融合蛋白的变化。并通过Western blot检测蛋白的裂解情况,表明Hc-FAUA在细胞中既有融合的形式,也有裂解的形式。而Hc-FAUB主要以融合的形式存在。在单独表达UBiL或是S30结构域时,它们可以与其它蛋白相互作用。通过SwissModel对结构域进行预测,Hc-FAUB在N端比Hc-FAUA缺少的23个氨基酸由2个p折叠和1个α螺旋组成,结合试验,这个结构对于Hc-FAUA-UBiL的功能起到抑制的作用。通过结构预测与试验验证,验证了S30的核定位信号,并鉴定出了其核仁定位信号。综上所述,Hc-fau对于H. contortus L4滞育可能具有很重要的调节作用,探明Hc-fau在H. contortus L4滞育过程的调节机制将为捻转血矛线虫病的防控提出新视角。