纤毛是以微管为基本结构特化形成的管状细胞器,广泛分布于人体的视网膜、鼻腔、肾小管、脊髓管、输卵管等组织器官的细胞表面,对胚胎发育、器官形成、细胞信号转导以及维持人体生理稳态等方面都发挥着关键作用。正因为纤毛在人体生命活动中承担多种生理功能,当纤毛结构和功能缺陷时常导致多种人类疾病,称为纤毛病（ciliopathy）,其中包括先天性心脏病、多囊肾、视网膜色素变性、纤毛不动综合征和不孕不育症等。因此,探究纤毛的发生机制及信号转导功能能够为今后相关疾病的治疗提供新的研究思路和方法。我们前期研究发现前列腺素E2（PGE2）通过跨膜转运蛋白ABC家族ABCC4转运出细胞,并作用于纤毛定位的G蛋白偶联受体EP4来调控细胞纤毛生长和斑马鱼内脏器官不对称发育。斑马鱼EP4受体家族有三个亚型EP4a、EP4b及EP4c,具体哪种EP4亚型定位于胚胎纤毛及它们的关键定位序列和功能仍不清楚,在本研究中,我们希望确定EP4受体不同亚型在胚胎不同器官中的纤毛定位情况,并探究EP4受体定位纤毛的关键氨基酸序列。在本研究中,我们以斑马鱼为动物模型,首次证明了PGE2-EP4信号通路中,仅有EP4c亚型受体定位于肾管、耳泡、脊髓管、体表、视网膜等多个重要部位的纤毛膜上。EP4c受体属于G蛋白偶联受体家族,该蛋白家族一般都含有7次跨膜及4个胞内区,以往研究发现影响G蛋白偶联受体定位于纤毛的关键序列大都集中在第三胞内区和第四胞内区,我们通过分析斑马鱼EP4家族三个亚型之间的氨基酸序列,发现EP4c第三个胞内区和第四个胞内区的氨基酸序列与EP4a、EP4b及其他EP家族氨基酸序列差异最大。我们选择这两段序列作为研究目标。我们利用构建的含有报告基因的Tol2-ep4c（i3 del）-cherry（EP4c第三胞内段缺失的融合蛋白）和Tol2-ep4c（i4 del）-cherry（EP4c第四胞内段缺失的融合蛋白）质粒,分析了EP4c突变后的纤毛定位情况,初步明确了EP4c第三胞内区或第四胞内区缺失后,EP4c将无法定位纤毛。为了进一步确定EP4c第三胞内段和第四胞内段的纤毛定位功能,我们把该序列分别置换到非纤毛定位的EP4a亚型的相同位置,构建了Tol2-ep4a（i3del+ep4c i3）-cherry和Tol2-ep4a（i4 del+ep4c i4）-cherry质粒,并注射到斑马鱼胚胎中,发现置换后的EP4a能够定位于纤毛上。由此我们认为,EP4c能够定位于纤毛的关键序列主要存在于第三胞内区和第四胞内区。接下来,我们研究了纤毛定位的EP4c在斑马鱼胚胎视网膜发育中的功能,通过吗啡啉介导的基因敲低技术下调EP4c的表达,发现视网膜连接纤毛长度明显变短。这个结果说明EP4c对视网膜纤毛生长发育有重要作用。为了更好地探究EP4c的功能,我们利用大片段删除技术构建了EP4c纯合突变体以备后续研究。PGE2-EP4信号主要通过激活腺苷酸环化酶（adenylatecyclase,AC）,提升胞内第二信使c AMP浓度,进而将信号向下游传导。一直以来,鲜有学者深入探究过PGE2-EP4信号下游腺苷酸环化酶的定位。AC酶在哺乳动物中共有9种亚型,斑马鱼目前已知有12种亚型,有哪些AC酶定位于纤毛,并有可能在纤毛内接受PGE2-EP4信号仍不清楚,这些问题都值得我们进一步研究。斑马鱼中存在的腺苷酸环化酶亚型包括AC1a、AC1b、AC2a、AC2b、AC3a、AC3b、AC5、AC6a、AC6b、AC7、AC8、AC9。我们通过亚细胞定位实验,发现只有三类腺苷酸环化酶亚型定位于纤毛,分别是AC3a、AC5、AC6b;为进一步探究其定位于纤毛的特殊作用,我们选择在实验室已构建的斑马鱼纯合突变体AC3-/-AC5-/-中下调AC6b蛋白的表达,结果显示胚胎具有典型的纤毛发育异常的表型。我们又通过胚胎免疫染色实验发现在缺失AC3a、AC5、AC6b的情况下,胚胎纤毛数目明显减少,这也说明定位于纤毛的腺苷酸环化酶对纤毛生长发育起着关键作用。为了更好地探究PGE2-EP4-AC信号通路对纤毛生长发育的功能,我们在AC3-/-AC5-/-纯合突变体的基础上,正在利用CRISPR/Cas9技术构建AC3-/-AC5-/-AC6b-/-纯合突变体。通过上述研究,我们已初步确定在斑马鱼EP4c受体定位纤毛的关键氨基酸序列,并进一步探究EP4受体下游腺苷酸环化酶的定位和初步功能。这为我们后续探究前列腺素信号通路如何通过调控纤毛发生进而影响脊椎动物发育提供了理论支持。