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目的:本课题通过检测克柔念珠菌临床分离株不同组间的耐药基因表达差异,初步探讨其对伊曲康唑耐药的主要分子机制。方法:1.收集临床菌株:克柔念珠菌均来源于天津市第一中心医院从临床送检标本中分离的菌株,均经过科马嘉显色培养基、VITEK 2微生物鉴定系统和质谱仪鉴定标本。2.体外抗真菌药敏试验:按照ATB FUNGUS 3试条检测克柔念珠菌体外对伊曲康唑的敏感性,同时利用酵母样真菌微量稀释法药敏板对药敏结果进行验证,并根据MIC值将菌株分成3组:伊曲康唑敏感组(S)、剂量依赖性敏感组(SDD)、耐药组(R)。本实验质控菌株为近平滑念珠菌(ATCC 22019)和克柔念珠菌(ATCC 6258)。3.检测耐药相关基因的突变:提取克柔念珠菌基因组DNA,对靶酶基因ERG11进行扩增和测序,比较伊曲康唑敏感组、剂量依赖性敏感组和耐药组ERG11基因有无核苷酸突变差异。4.检测耐药相关基因的m RNA表达情况:提取克柔念珠菌总RNA,对其进行反转录,采用实时荧光定量RT-PCR,比较伊曲康唑敏感组、剂量依赖性敏感组和耐药组靶酶基因ERG11、外排泵编码基因ABC1和ABC2的m RNA表达差异。结果:1.本实验共收集16株克柔念珠菌临床菌株,其中伊曲康唑敏感组3株,剂量依赖性敏感组8株,耐药组5株;2.16株克柔念珠菌ERG11基因共存在7个突变位点,其中6个同义突变,1个错义突变(C44T),但三组中均可出现该错义突变;3.克柔念珠菌临床分离株伊曲康唑耐药组ERG11基因m RNA表达量较剂量依赖性敏感组和敏感组高(分别P=0.015和P=0.002);耐药组ABC2基因m RNA表达量也较剂量依赖性敏感组和敏感组高(分别P=0.016和P<0.001),且剂量依赖性敏感组m RNA表达量高于敏感组(P=0.007);而耐药组ABC1基因m RNA量表达较低。1株同时耐伊曲康唑和伏立康唑的克柔念珠菌(CK10),其ERG11、ABC1和ABC2基因m RNA表达水平在所有耐药株中均为最高。结论:1.靶酶编码基因ERG11的基因序列存在单核苷酸多态性(SNP),未发现克柔念珠菌临床分离株存在与伊曲康唑耐药有关的突变位点。2.靶酶编码基因ERG11和外排泵编码基因ABC2的表达上调可能是克柔念珠菌临床分离株耐伊曲康唑的主要分子机制。