番茄斑萎病毒病毒粒体的提取纯化及质谱分析

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hejiankimi
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番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的代表种,该属病毒是唯一侵染植物的病毒。由于该病毒的寄主广泛,主要传毒介体西花蓟马分布范围广,且传毒持久,造成了全球范围内严重的经济损失,因此对于番茄斑萎病毒的研究是非常有迫切及有意义的。  本研究通过在本氏烟及黄烟上摩擦接种TSWV,并收集发病系统叶,蔗糖梯度离心提取TSWV病毒颗粒,并通过SDS-PAGE验证获得了纯度较高的病毒颗粒,进一步进行质谱分析,分析结果为提取出的病毒颗粒中含有病毒蛋白如复制蛋白RdRp、糖蛋白Gn、Gc、非结构蛋白NSs、核衣壳蛋白N,另外还有植物蛋白hsp70、Sar1等。  由于TSWV的外壳蛋白N可以与RdRp结合形成Ribonucleoprotein(RNP),主要负责病毒的复制与转录,对于研究该病毒的形成具有重大作用。但是由于RdRp蛋白太大,难以完整表达,因此在本研究中通过分片段克隆插入载体,再通过原核表达不同片段的方式测试其与N的互作。将原核表达的RdRp不同片段与N互作,发现带有His标签的RdRp2380-2878aa片段与GST-N有微弱的互作现象,设置阴性对照排除了GST蛋白与RdRp互作的可能。  由于质谱分析发现提取出的TSWV病毒颗粒中含有植物中的蛋白Sar1,该蛋白是参与内质网上COPⅡ衣被的形成,对于研究病毒颗粒在植物体内的复制转移机制十分有价值,为此制备了该蛋白的多克隆抗体及转基因本氏烟植株以备下一步的研究。通过免疫小鼠及效价测定获得了效价为1∶4000的Sar1多克隆抗体,通过Western Blot检测证明该多克隆抗体可以特异性检测Sar1蛋白,且效果较好。通过农杆菌转导的方法将带有YFP标签的Sar1转入本氏烟烟草中获得转基因烟草,激光共聚焦及Western Blot验证Sar1基因成功转入本氏烟烟草中。  烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一种单链RNA病毒,能够感染烟草及其他茄科植物。CRISPR-Cas9系统是目前最高效的基因组编辑系统,已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞。本研究通过构建CRISPR/Cas9载体,攻击TMV基因组来抑制TMV的侵染,通过与农杆菌共浸润本氏烟烟草,观察荧光斑点数及范围来验证,发现两个攻击位点有效,抑制了TMV的侵染,另两个没有明显效果,初步推断为攻击位点不正确。
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